Разработка комплексного биотехнологического подхода для биологической защиты КРС и продукции животноводства от патогенных бактерий и их токсинов.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-16-20007

НазваниеРазработка комплексного биотехнологического подхода для биологической защиты КРС и продукции животноводства от патогенных бактерий и их токсинов.

Руководитель Ильина Лариса Александровна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный аграрный университет" , г Санкт-Петербург

Конкурс №77 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (региональный конкурс)

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-204 - Животноводство

Ключевые слова Силос, патогенные бактерии, токсины, Clostridium sp., Enterobacteriaceae, биопрепараты, ПЦР тест-система

Код ГРНТИ68.39.57

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Научный проект посвящен актуальной проблеме безопасности животноводческой продукции, в том числе кормов для животных, связанной с ограничением распространения таких опасных возбудителей заболеваний как Clostridium sp. и бактерии сем. Enterobacteriaceae, продуцирующие различные токсины, вызывающие заболевания человека. Наиболее распространенными и опасными патогенными микроорганизмами, обнаруживаемыми в кормах животных, являются энтеробактерии, особенно шига-токсинпродуцирущие и Clostridium sp. Шига-токсинпродуцирующие энтеробактерии вызывают значительную заболеваемость и смертность во всем мире. Cl. perfringens, Cl. botulinum и прочие клостридии продуцируют ряд опасных токсинов, интоксикация организма которыми может приводить к летальному исходу. Циркуляция патогенных бактерий происходит в системе корма - ЖКТ животных - продукция животноводства (молоко) при нарушении технологических процессов. Одним из основных способов заготовки кормов для КРС в условиях рискованного земледелия в которой расположен Санкт-Петербург является силосование или консервирование растительных кормов для КРС. В норме консервация силоса достигается за счет быстрого снижения pН среды, которое обеспечивается при помощи молочнокислых бактерий. При нарушении процессов, когда закисление среды происходит недостаточно быстро, начинают размножаться патогенные и условно-патогенные микроорганизмы. В регионе г. Санкт-Петербурга преобладает высокая влажность воздуха, что связано с особенностями географического расположения региона. В условиях повышенной влажности заготовка качественного силоса становится сложной задачей и возникают проблемы, связанные с развитием в нем нежелательной микробиоты, потери качества и питательности. Научная новизна проекта заключается в том, что в настоящее время большое число исследований посвящено токсинам грибов – микотоксинам. Изучается их распространение, накопление и вред, наносимый сельскому хозяйству. Вместе с этим, проблеме распространения опасных для человека токсинов патогенных бактерий уделено значительно меньшее внимание, хотя во всем мире данная проблема сейчас выходит на первые позиции. Ведь силос является основным источником попадания патогенных бактерий в организм коровы и, вероятно, впоследствии в молоко. Таким образом, все виды микроорганизмов, которые содержатся в силосе на момент его кормления могут быть найдены впоследствии в конечных продуктах, например, молоке. Поэтому очень важно получать силос высокого качества, не несущий риск для здоровья животных и, в конечном счёте, для людей. В проекте можно выделить несколько основных задач: 1. Проведение мониторинга распространения бактериальных токсинов (Clostridium sp. и сем. Enterobacteriaceae) в кормах, ЖКТ крупного рогатого скота и молоке в хозяйствах, расположенных на территории Санкт-Петербурга. 2. Разработка ПЦР тест-системы для быстрого выявления токсинов бактерий (Clostridium sp. и сем. Enterobacteriaceae) в кормах, ЖКТ и молоке. 3. Создание биологического препарата (закваски) для эффективного консервирования кормов в условиях рискованного земледелия. Для повышения качества процессов силосования кормов будет разработан двуштаммовый препарат, обладающий способностью к быстрому закислению среды и антимикробной активностью в отношении клостридий и энтеробактерий. Использование двух штаммов даст биопрепарату большую гибкость в различных условиях среды и позволит проводить процесс заготовки объемистых кормов на качественно новом уровне. В результате будет достигнута цель повышения продуктивности и здоровья жвачных сельскохозяйственных животных, качества и безопасности продукции животноводства в Санкт-Петербурге. Полученные результаты будут применимы не только в Санкт-Петербурге, но и на других территориях Российской Федерации, находящихся в зонах рискованного земледелия.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Дубровин А.В., Ильина Л.А., Пономарева Е.С., Калиткина К.А., Йылдырым Е.А., Филиппова В.А., Дубровина А.С. Бактериальные токсины в кормах сельскохозяйственных птиц и животных: обзор Птицеводство, №1, С. 55-60. (год публикации - 2024)
10.33845/0033-3239-2024-73-1-55-60

2. Лаптев Г.Ю., Солдатова В.В., Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Тюрина Д.Г., Спиридонов А.М., Филиппова В.А., Калиткина К.А., Пономарева Е.С. Ахматчин Д.А. Эффективность кормовой добавки Антиклос в кормлении лактирующих коров черно-пестрой породы Молочное и мясное скотоводство, № 1, 36-40 (год публикации - 2024)
10.33943/MMS.2024.87.51.006

3. Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Филиппова В.А., Калиткина К.А., Дубровин А.В. Состав микрофлоры химуса пищеварительной системы и молочная продуктивность коров в период раздоя под влиянием комплексного биопрепарата Аграрный вестник Урала, Т.24, №1, С.46-58 (год публикации - 2024)
10.32417/1997-4868-2024-24-01-46-58

4. Йылдырым Е.А., Лаптев Г.Ю., Ильина Л.А., Филиппова В.А., Калиткина К.А., Пономарева Е.С., Тюрина Д.С., Спиридонов А.М. Метагеномные профили бактериальных сообществ поверхности растений и силоса Известия Санкт-Петербургского государственного аграрного университета, 7 (73), С. 89-97. (год публикации - 2023)

5. Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Лаптев Г.Ю., Малахов И.Г. Анализ патогенной микрофлоры в образцах силоса, молока и фекалий методом qPCR Материалы международной научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава, посвященной 190-летию со дня рождения И.А. Стебута «Приоритеты развития АПК в условиях цифровизации и структурных изменений национальной экономики», С. 108-109 (год публикации - 2023)

6. Ильина Л.А., Филиппова В.А., Йылдырым Е.А., Лаптев Г.Ю., Пономарева Е.С., Дубровин А.В., Калиткина К.А., Скляров С.П. Biomonitoring of silage microbial community dynamics under the influence of microbial strains application "Fundamental and Applied Scientific Research in the Development of Agriculture in the Far East - AFE-2023", 462, 02005 (год публикации - 2024)
10.1051/e3sconf/202346202005

7. Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Лаптев Г.Ю., Филиппова В.А., Солдатова В.В., Ахматчин Д.А. Пробиотик для снижения токсинов и повышения надоя у коров «Труды Кубанского государственного аграрного университета», № 107 (год публикации - 2023)
10.21515/1999-1703-107-245-249

8. Ильина Л.А. Современные представления о микробиоме КРС и его связи со здоровьем, продуктивностью и воспроизводством 33-я Международная агропромышленная выставка «АГРОРУСЬ», Санкт-Петербург (год публикации - 2024)

9. Ильина Л.А. Проблема контаминации кормов собственной заготовки КРС экзотоксинами бактерий Clostridium perfringens и Escherichia coli и разработка подходов к ее решению Международный научный форум «Современные достижения и проблемы разведения, селекции, генетики и биотехнологии в животноводстве», посвященного 95-летию со дня основания ВИЖа и 95-летию со дня рождения академика Л.К. Эрнста, Москва (год публикации - 2024)

10. Филиппова В.А, Ильина Л.А., Йылдырым Е.А., Пономарева Е.С., Лаптев Г.Ю. Analysis of Clostridium Perfringens, C. Difficile and Pathogenic E. Coli Toxins Distribution in Feed, Gastrointestinal Tract and Milk of Healthy and Malnourished Cattle Lecture Notes in Networks and Systems, volume 857, pp 59–68 (год публикации - 2024)
10.1007/978-3-031-72556-2_7

11. Филиппова В.А., Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Лаптев Г. Ю., Дубровин А.В., Заикин В.А., Калиткина К.А., Дубровина А.С., Малахов И.Г., Ключникова И.А. Анализ присутствия токсинов Escherichia coli, Clostridium perfringens, C. difficile в объемистых кормах Санкт-Петербурга и Ленинградской области Siberian Journal of Life Sciences and Agriculture, Т.16, №4. (год публикации - 2024)
10.12731/2658-6649-2024-16-4-858

12. Ильина Л.А., Йылдырым Е.А., Лаптев Г. Ю., Филиппова В.А., Ключникова И.А., Скляров С.П. Мониторинг присутствия детерминант токсичности Clostridium perfringens в консервированных кормах Труды Кубанского государственного аграрного университета, № 116 (год публикации - 2024)
10.21515/1999-1703-116-258-263

13. Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Лаптев Г.Ю., Тюрина Д.Г., Филиппова В.А., Дубровин А.В., Новикова Н.И., Калиткина К.А., Джепбарова О., Пономарева Е.С., Дубровина А.С., Ключникова И.А., Патюкова Н.С, Гриффин Д., Романов М.Н. The Search for Sources of Enterobacteria and Clostridia Endotoxins in Russian Dairy Farms: Possible Transfer of Endotoxins Through the Feed-Cow-Milk Chain AGRICULTURE DIGITALIZATION AND ORGANIC PRODUCTION, volume 397, pp 325–335 (год публикации - 2024)
10.1007/978-981-97-4410-7_27

14. Ильина Л.А., Филиппова В.А., Йылдырым Е.А., Пономарева Е.С., Заикин В.А., Ключникова И.А., Калиткина К.А., Лаптев Г.Ю. Бактериальные экзотоксины в кормах сельскохозяйственных животных и способы их нейтрализации Международная научно-практическая конференция по сельскохозяйственным наукам, биотехнологии и пищевым технологиям "Инновации и устойчивое развитие в агропродовольственных системах и биотехнологических науках: современные вызовы и решения" AGRIBIOFOOD 2024 (год публикации - 2024)

15. Ильина Л.А. Разработка биопрепарата для снижения контаминации кормов собственной заготовки токсинами клостридий и энтеробактерий Международная научно-практическая конференция «АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ЗООТЕХНИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ», Санкт-Петербург (год публикации - 2024)

16. Ильина Л.А. Современные биотехнологии для разработки новых эффективных биологических консервантов и получения безопасных кормов III международный конгресс по кормам, посвященный выдающимся ученым-луговодам и геоботаникам Л.Г. Раменскому, С.П. Смелову, Т.А. Работнову, Москва (год публикации - 2024)

17. Ильина Л.А., Филиппова В.А. Бактериальные экзотоксины у крупного рогатого скота и пути их нейтрализации VI Международная научная конференция «Микробиота человека и животных», Санкт-Петербург (год публикации - 2024)

18. Ильина Л.А., Филиппова В.А., Йылдырым Э.А., Склыров С.П., Лаптев Г.Ю. Analysis of Pathogenic Escherichia coli Toxin and Virulence Genes Distribution in Canned Feed of Dairy Cattle Innovations in Sustainable Agricultural Systems, Agriculture 4.0 and Precision Agriculture, vol 1534 pp 362–370 (год публикации - 2025)
10.1007/978-3-031-98127-2_37

19. Филиппова В.А., Ильина Л.А., Йылдырым Е.А., Пономарева Е.С., Ключникова И.А., Дубровин А.В., Калиткина К.А., Заикин В.А., Лаптев Г.Ю. Assessing the Risk of Spreading Clostridioides difficile and Its Toxins Within the Dairy Farm Animals, 14(21), 3148 (год публикации - 2024)
10.3390/ani14213148

20. Филиппова В.А., Ильина Л.А., Йылдырым Е.А., Дубровин А.В., Соколова К.А., Пономарева Е.С., Дубровина А.С., Ключникова И.А., Заикин В.А., Малахов И.Г., Лаптев Г.Ю., Гриффин Д.К., Романов М.Н. Effectiveness Evaluation of Microbiological Preparations for Preserving Ensiled Plant Feeds in a Model Experiment Using Microbiomic and Bioinformatic Tools AGRICULTURE DIGITALIZATION AND ORGANIC PRODUCTION (год публикации - 2025)

21. Ильина Л.А. , Малахов И.Г., Заикин В.А., Лаптев Г.Ю. Морозов В.Ю., Скляров С.П. Влияние штаммов Enterococcus faecium и Bacillus subtilis на микробиоту и питательность силоса из злако-бобовой травосмеси ИЗВЕСТИЯ ТИМИРЯЗЕВСКОЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ АКАДЕМИИ (год публикации - 2025)

22. Филиппова В.А., Лаптев Г.Ю., Ильина Л.А., Йылдырым Е.А., Пономарева Е.С., Бражник Е.А., Новикова Н.И., Тюрина Д.Г., Дубровин А.В., Дубровина А.С., Соколова К.А., Ключникова И.А., Заикин В.А., Грифон Д.К., Романов М.Н. Comparative Genomics of Two Novel Bacillus Strains: Microbiomic Insights into the Sequences, Metabolomics, and Potential Safe Use in the Creation of Biopreparations Frontiers in Bioscience-Elite, 2025; 17(2): 28227 (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.31083/FBE28227

23. Филиппова В.А., Ильина Л.А., Йылдырым Е.А., Соколова К.А., Пономарева Е.С. New strains of lactic acid bacteria Lacticaseibacillus pracasei, Enterococcus faecium, and Lactobacillus plantarum for coarse feed silage in the Leningrad region BIO Web of Conferences. IDSISA 2025, 179, 01018 (2025) (год публикации - 2025)
10.1051/bioconf/202517901018

24. Ильина Л. А., Лаптев Г. Ю., Савенко Ю. П., Филиппова В. А., Йылдырым Е. А., Тюрина Д. Г. Новикова Н. И., Заикин В. А., Соколова К. А., Малахов И. Г., Скляров С. П., Морозов В. Ю. Бактериальные токсины патогенных бактерий в объемистых кормах КРС собственной заготовки и способы их нейтрализации: методические рекомендации для обучающихся по направлению подготовки 36.03.02 Зоотехния Бактериальные токсины патогенных бактерий в объемистых кормах КРС собственной заготовки и способы их нейтрализации: методические рекомендации для обучающихся по направлению подготовки 36.03.02 Зоотехния, ФГБОУ ВО СПбГАУ, 2025 (год публикации - 2025)

25. Ильина Л.А., Малахов И.Г., Скляров С.П., Лаптев Г.Ю. МОЛОЧНАЯ ПРОДУКТИВНОСТЬ КОРОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ НОВЫХ КОРМОВЫХ ДОБАВОК Труды Кубанского государственного аграрного университета (год публикации - 2025)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Во 2 год реализации Проекта (2024 гг.) выполнен ряд задач, направленных на изучение свойств штаммов, перспективных для создания нового препарата для консервирования кормов, разработку технологической схемы производства, а также проведение модельных лабораторных экспериментов, в ходе которых оценена эффективность биопрепарата. Для характеристики свойств выделенных на предыдущем этапе исследований штаммов и оценки перспективы их использования для создания нового консерванта нами были исследованы их морфолого-культуральные и физиолого-биохимические показатели. Далее для 6 наиболее перспективных штаммов проанализированы геномы с применением метода NGS-секвенирование и биоинформатических инструментов, что позволило охарактеризовать генетические факторы, определяющие их конкурентоспособность. Определены особенности штаммов, связанные с их антимикробной активностью, в т.ч. спектр генов синтеза органических кислот и бактериоцинов, детерминант устойчивости к антибиотикам. Определены гены, связанные с осмотической устойчивостью штаммов, что связано с их применимостью в качестве заквасок для заготовки силоса. В частности, у всех штаммов выявлены транспортеры ABC OpuA и OpuВ, опосредующие импорт осмопротектора глицинбетаина. У штаммов Lactobacillus plantarum выявлены гены синтеза различных аквапоринов - GlpF, PduF, Аквапорина Z. В геноме остальных штаммов выявлен только белок GlpF. У штамма Bacillus subtilis 18 обнаружен механизм синтеза глицин бетаина - эффективного осмопротектора. Все штаммы обладали генами белков, связанных с предотвращением окислительного стресса, в т.ч. PerR, ОxyR, которые чувствительны к уровню перекиси водорода. На следующем этапе были изучены технологические свойства штаммов и разработаны технологические схемы производства двуштаммового биопрепарата. При оценке сохранения жизнеспособности изолятов при длительном хранении до 180 суток отмечено незначительное снижение титра при температуре 25°С после полугодового срока хранения, что имеет высокую технологическую ценность. При этом перекрестного антагонизма между штаммами не установлено. Далее проведено исследование эффективности штаммов в качестве консервантов в условиях модельных лабораторных экспериментов. Эксперимент включал контрольный вариант и 9 новых опытных вариантов (консерванты на основе одного или двух новых штаммов). Исследования проводили в два этапа: консервирование кормов и оценку их аэробной стабильности. По данным биохимических исследований все образцы характеризовались высокими показателями питательности. Более быстрое подкисление к 3 суткам происходило при использовании штаммов варианта №2 (L. plantarum 50 + E. faecium 46). Общее количество молочной кислоты в образцах было наиболее высоким (выше 70%) в 6 образцах. В 2 вариантах из 10 соотношение между молочной и уксусной кислот составило выше 3, что свидетельствует о быстром и контролируемом ходе силосования. Небольшие количества масляной кислоты обнаружены в 5 образцах из 10, что может свидетельствовать о начале развития в силосе клостридий. Наилучшая сохранность силоса в условиях оценки аэробной стабильности - доступа кислорода (21-25 суток) была достигнута в вариантах, где использовались три комбинации штаммов №2 (L. plantarum 50 + E. faecium 46), №3 (L. paracasei 6 + E. faecium 46) и №4 (E. faecium 46 + B. subtilis 18). При исследовании загрязненности кормов токсинами клостридий и энтеробактерий были получены интересные закономерности. На 3 сутки после начала эксперимента в некоторых вариантах обнаруживались генов токсичности C. perfringens (в 5 случаях выявлен эпсилон-токсин, в 2 случаях - бета-токсин), а также гены бинарного токсина C. difficile в 5 случаях. Далее на 8, 15 и 30 сутки после начала эксперимента присутствия токсинов клостридий и энтеробактерий в образцах обнаружено не было. При проведении анализа накопления токсинов в ходе анализа аэробной стабильности сразу после открытия доступа кислорода гены токсинов в образцах не обнаруживались, в конце эксперимента выявлялся только эпсилон-токсин C.perfringens в 2 образцах (1 вариант – контроль и 5 вариант –L. paracasei 6 + L.paracasei 3). Изменения в бактериальном сообществе силоса под влиянием штаммов-консервантов, оценивали методом NGS-секвенирование (исходное сырье, на 3, 8, 15 и 30 сутки после начала опыта и далее при оценке аэробной стабильности). В исходной растительной массе доминировали бактерии Weissella – 48,35%, доля других таксонов составляла от 1 до 3% (Pseudomonas, Rhizobium, Leuconostoc, Stenotrophomonas, Serratia, Devosia и Erwiniaceae). Отмечено присутствие клостридий Clostridium_sensu_stricto_9 - 0,02% и сем. Enterobacteriaceae – 2,09%. На 3 сутки опыта в микробиоте силоса наблюдалось повышение во всех образцах доли Firmicutes до 90-97%, преимущественно 3 родов лактобактерий – Weissella, Lactobacillus, Pediococcus. Основные отличия между вариантами оказались связаны с соотношением данных родов. Достоверно более высокое содержание представителей Lactobacillus (p≤0,05) детектировалось в вариантах 1 (контроль), 4 (L. paracasei 6 и E.faecium 46) и 8 (L. plantarum 50). На 8 и 15 сутки во всех образцах сохранялось доминирование лактобактерий Weissella, Lactobacillus, Pediococcus. В конце опыта доля лактобацилл снизилась практически во всех вариантах, с одновременным ростом доли рода Weissella. При анализе аэробной стабильности после открытия доступа кислорода во всех образцах увеличилось количество спорообразующих бацилл и клостридий. Оценка корреляций между долей бактерий в силосе и показателями питательности показала, что бактерии рода Lactobacillus имели отрицательную связь с содержанием в нем масляной кислоты (-0,47). Содержание бактерий рода Weissella в образцах имело положительную связь с содержанием сырой клетчатки (0,49). При этом оба рода являлись своеобразными антагонистами и имели высокий уровень отрицательной кореляции между собой (-0,77). Таким образом, подтверждается сделанный нами ранее вывод о том, что качество силоса тесно связано с присутствием в нем бактерий рода Lactobacillus. По результатам экспериментов было показано, что наибольшая стабильность микробиоты и высокая доля лактобактерий, лучшие показатели уровня рН, питательности и сохранности силоса достигнуты при использовании комбинации штаммов №2 (L. plantarum 50 + E. faecium 46). Она является наиболее перспективной для нового препарата для заготовки объёмистых кормов для КРС в условиях зоны рискованного земледелия, куда относится Санкт-Петербург и Ленинградская область вследствие географического положения и повышенной влажности, поскольку потенциальный эффект от его применения связан с обеспечением защиты животных от патогенов (клостридий и энтеробактерий) и их токсинов, улучшения здоровья животных, получения безопасной для человека продукции. В рамках 3 года выполнения проекта запланировано изучение эффективности нового препарата в условиях производственного эксперимента.

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В 3 год реализации Проекта была изучена эффективность нового разработанного двуштаммового биоконсерванта в условиях лабораторного и производственного экспериментов. На первом этапе выполнен сравнительный анализ эффективности двух новых биопрепаратов в модельных условиях на злаковой травосмеси. Эксперимент включал контрольный и 2 опытных варианта (1 вариант L. plantarum 50 + E. faecium 46 и 2 вариант B. subtilis 18 + E. faecium 46). Исследования проводили в два этапа: консервирование кормов и оценка их аэробной стабильности. Более активное подкисление и накопление молочной кислоты происходило в варианте 1, что свидетельствует о быстром и контролируемом процессе силосования, о чем свидетельствуют наиболее высокие показатели готового силоса по обменной энергии. Наиболее высокие показатели по сухому веществу (25,4 и 24,1%) выявлены в опытных образцах. Результаты анализа аэробной стабильности готового силоса были наилучшими для опытных вариантов. Отмечено позитивное влияние консервантов на состав микробиоты силоса. В опытном варианте 1 наблюдалось значимое ингибирование таксонов порчи (Escherichia coli, Enterobacter. Bacteroides и др.) при возрастании количества Lactobacillus и Enterococcus (p≤0,05). При анализе аэробной стабильности после открытия доступа кислорода во всех образцах увеличилось содержание Proteus vulgaris/mirabilis, Enterobacter, Escherichia coli и Streptococcus. При этом в 1 опытном варианте наблюдалось достоверно меньшее количество (p≤0,05) Escherichia coli, Enterobacter и Acinetobacter. При оценке загрязненности полученных кормов токсинами клостридий и энтеробактерий отмечено позитивное влияние биопрепаратов. В 1 сутки ферментации во всех образцах наблюдалось присутствие генов шигатоксинов Escherichia coli, C. perfringens cpb, etx, cpa1 и C. difficile – ctdB, количество которых было существенно ниже в образцах кормов с добавлением консервантов. Наименьшее их количество наблюдалось при использовании биоконсерванта на основе штаммов L. plantarum 50 + E. faecium 46. При анализе аэробной стабильности силоса после открытия доступа кислорода наблюдалось повышение представленности генов токсичности (в т.ч. Cpi и stx2b), которое в опытных группах сдерживалось, в отличие от контроля. В совокупности по результатам модельного лабораторного эксперимента подтверждена высокая эффективность нового биоконсерванта на основе L. plantarum 50 + E. faecium 46, применение которого обеспечивало высокие показатели качества, питательности и микробиологической безопасности силоса. Далее нами была проведена оценка эффективности указанного биопрепарата в производственных условиях. В рамках 1 научно-производственного эксперимента была изучена динамика бактериального сообщества в силосуемой массе при использовании биопрепарата и без него на различных этапах ферментации, накопление в корме генов токсичности клостридий и энтеробактерий, их переход по цепочке «корма-ЖКТ-молоко», а также показатели здоровья и продуктивности коров. Животные опытной группы перед началом эксперимента получали стандартный рацион, принятый в хозяйстве. Коровам опытной группы в течение эксперимента скармливали рацион с силосом, заготовленным с новым двухштаммовым биоконсервантом, контрольной группы – силос без консерванта. Силос, заготовленный с новым биоконсервантом, отличался от других вариантов наименьшим уровнем рН (p≤0,05), более высокими показателями обменной энергии (p≤0,05) и высокой массовой долей молочной кислоты в общем количестве кислот, что свидетельствует об эффективности ферментации силоса и высокой сохранности в нем питательных веществ. Анализ формирования микробиоты силоса методом NGS-секвенирования показал, что в опытном варианте с биоконсервантом наблюдалось преобладание бактерий филы Firmicutes (в т.ч. рода Lactobacillus) на протяжении периода исследования, вторыми по численности были Proteobacteria, доля которых снижалась до 11,96% на 60-й день. Без биопрепарата наблюдалась другая картина динамики микробиоты, свидетельствующая о неконтролируемой спонтанной ферментации и замедленном развитии Lactobacillus, что приводило к накоплению нежелательных бактерий, в т.ч. Bacteroides, способствующих деградации питательных соединений. На фоне использования биоконсерванта и без него были выявлены ключевые метаболические пути, активность которых значительно различалась. К 30-му дню ферментации эти различия становились более заметными. В опытном варианте в этот период наблюдается активация путей метаболизма валина (VALDEG-PWY), синтеза липидов LIPASYN-PWY и P162-PWY. В контрольной группе отмечена активная работа путей деградации и метаболизма липополисахаридов (LPSSYN-PWY). Под действием нового биоконсерванта наблюдалось снижение распространения детерминант токсичности в силосе. Так, начиная с 7 суток ферментации в опытном варианте отмечено отсутствие генов шигатоксинов E. coli и альфа-токсина Clostridium perfringens, которые выявлялись в контроле в период с 1 по 30 день ферментации. Исследования распространения токсинов клостридий и энтеробактерий по цепочке «кормовой стол-фекалии-молоко коров» продемонстрировали позитивный эффект от скармливания животным силоса с биоконсервантом. У коров опытной группы выявлена оптимизация показателей гемоглобина, эозинофилов, обменных и иммунных процессов, в частности по количеству мочевины, кальция и амилазной активности. Дополнительный экономический эффект от применения нового биоконсерванта при силосовании составил +9,14% по сравнению с контролем. В рамках 2 научно-хозяйственного эксперимента установлено, что применение нового биоконсерванта для заготовки силоса из злако-бобовой смеси, приводило к повышению показателей питательности, включая количество сухого вещества, сырого протеина, переваримость протеина в кишечнике, а также баланс азота в рубце животных. По результатам производственной апробации установлено, что применение нового биоконсерванта приводило к оптимизации процессов ферментации силоса, способствовало снижению накопления в нем детерминант токсичности клостридий и энтеробактерий, сохранению питательных веществ, что оказывало позитивное влияние на здоровье и продуктивность животных. По результатам исследований подготовлены методические рекомендации, включающие практические предложения по использованию разработанной тест-системы для быстрого скрининга токсинов клостридий и энтеробактерий в консервированных кормах, содержимом кишечника и молоке коров, а также по применению разработанного биологического препарата для получения качественных объемистых консервированных кормов в условиях Санкт-Петербурга и других регионов рискованного земледелия.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Значимость результатов проекта для г. Санкт-Петербург и страны обусловлена следующим: 1) в рамках проекта разработана ПЦР тест-система для быстрого скрининга токсинов клостридий и энтеробактерий, которая может использоваться в различных отраслях сельского хозяйства и медицины; 2) разработан новый конкурентноспособный импортозамещающий биологический препарат, который будет широко востребован для консервирования кормов для крупного рогатого скота, в частности в зонах рискованного земледелия и других регионах страны; 3) разработанные биотехнологии будут способствовать снижению рисков заболеваний животных и человека, связанных с развитием токсикоинфекций, поскольку позволят обеспечить высокие показатели здоровья и продуктивности сельскохозяйственных животных и получать биологически безопасную для человека продукцию животноводства.