Разработка микрофлюидных биосенсоров на основе гигантского комбинационного рассеяния света

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-19-00788

НазваниеРазработка микрофлюидных биосенсоров на основе гигантского комбинационного рассеяния света

Руководитель Сарычев Андрей Карлович, Доктор физико-математических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и прикладной электродинамики Российской академии наук , г Москва

Конкурс №80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 09 - Инженерные науки; 09-711 - Методы наноструктурирования (нанолитография и сопутствующие процессы)

Ключевые слова микрофлюидные биосенсоры, гигантское комбинационное рассеяние, плазмонный резонанс, нанорезонаторы

Код ГРНТИ29.19.22

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Гигантское комбинационное рассеяния (ГКР) света, которое вызвано локализованными плазмонными резонансами в металлических наноструктурах, позволяет разрабатывать высокоэффективные сенсоры для молекулярного анализа вещества и зондирования различных типов молекул. Луч лазера при рассеянии на молекуле приобретает дополнительные гармоники, соответствующие колебаниям исследуемой молекулы. Частоты гармоник определяют практически полный «портрет» исследуемых молекул. Метод ГКР уже сейчас позволяет определять физиологические концентрации важных биомаркеров крови, метаболиты, бактерии и вирусы, включая их малые концентрации. Ключевой стадией в разработке нового аналитического оборудования на основе ГКР и получении рекордной чувствительности определения являются разработка и создание структур, реализующих фокусировку и гигантское усиление электромагнитного поля. Несмотря на значительные успехи и в данной области, необходимы дополнительные методы и подходы для повышения чувствительности, устойчивости, предсказуемости и селективности оптической ГКР спектроскопии. Главным вкладом в усиление сигнала ГКР считается электромагнитный механизм за счет плазмонного резонанса в металлических наноструктурах позволяющий достигать усиления сигнала на четырех-десять порядков величины. Одновременно рассматривается т.н. химическое усиление является. При этом эти два «усиления» не складываются, а скорее, перемножаются. Сильная зависимость сигнала комбинационного рассеяния от наличия химической связи молекулы с подложкой противоречит электромагнитной теории. Фундаментальная природа эффекта ГКР включая соотношение «электромагнитного» и «химического» усиления будет экспериментально и теоретически исследоваться в ходе выполнения данного проекта. Для достижения дополнительного усиления сигнала ГКР предполагается создание новых оптических метаматериалов в виде резонансных микро- и наноструктурированных поверхностей, способных в результате повысить чувствительность зондирования органических и неорганических молекул. Авторы проекта в публикации 2022 показали, что значительное увеличение сигнала ГКР наблюдается при генерации гигантских флуктуаций электрического поля в модулированном интерфейсе металл-диэлектрик. Усиление сигнала ГКР достигается за счет эффекта поверхностной плазмонно-диэлектрической гибридизации локализованных плазмонов в наноструктурах с бегущими плазмонами в металлической нанопленке. Одним из наиважнейших направлений практического использования разрабатываемых систем является высокочувствительное экспресс-детектирование био-патогенов, например, коронавируса SARS-CoV-2 и его штаммов. Авторами данного проекта получен характеристический сигнал ГКР от рецептор-связывающего домена (RBD), отвечающего за проникновения вируса в клетку. Разрабатываемые в предполагаемом проекте новые ГКР-системы будут использованы для экспресс-детектирования спайкового гликопротеина (S-гликопротеина) коронавируса SARS-CoV-2. В проекте также будут разрабатываться ГКР-системы для выявления вирусных частиц SARS-CoV-2 или иных вирусных частиц по характерным спектрам комбинационного рассеяния различных поверхностных белков вириона. Мировой опыт исследований и разработок для биомедицины показывает, что для успешного перехода к персонализированной медицине одними из наиболее подходящих и перспективных являются диагностические платформы, основанные на микрофлюидных системах "лаборатория-на-чипе". В связи с этим, перспективным направлением работы будет интеграция ГКР структур в микрофлюидные системы. Такой подход позволит автоматизировать пробоподготовку и процесс проведения анализа, что имеет важно значение для прикроватной диагностики. У коллектива данного проекта имеется большой опыт не только разработок и создания микрофлюидных систем, опыт микро и нанофабрикации, но и большой задел в области медицинского приборостроения, регистрации медицинских изделий и внедрения разработок в медицинскую практику.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Сарычев А.К., Барбийон Г., Иванов А.В. Nanogap Plasmon Resonator: An Analytical Model Applied Sciences, 13, 12882, 1-13 (год публикации - 2023)
10.3390/app132312882

2. Сарычев А.К., Иванов А.В., Быков И.В., Бахолдин Н.В., Мочалов К.Е., Шестопалова М.С., Олейников В.А., Гущин В.А., Набиев И.Р., Суханова А.В. Planar SERS sensors for SARS-CoV-2 virus detection IEEE, 979-8-3503-7216-8/23 (год публикации - 2023)
10.1109/DD58728.2023.10325828

3. Сарычев А.К., Иванов А.В., Быков И.В., Мочалов К.Е., Шестопалова М.С., Олейников В.А. Electromagnetic theory of SERS effect of molecules encapsulated in spherical metal shell IEEE, 979-8-3503-7216-8/23 (год публикации - 2023)
10.1109/DD58728.2023.10325816

4. Иванов А.В., Сарычев А.К. Электромагнитная модель гигантского комбинационного излучения молекул в сферической металлической оболочке Фотон-Экспресс-Наука, 6,190,115 (год публикации - 2023)
10.24412/2308-6920-2023-6-115-115

5. Сарычев А.К., Иванов А.В., Быков И.В., Шестопалова М.С., Олейников В.А., Басманов Д.В., Прусаков К.А., Мочалов К.Е. Гигантское комбинационное излучение молекул в сферической металлической оболочке Прикладная Фотоника, 10, 7, 32-53 (год публикации - 2023)

6. Сарычев А.К., Иванов А.В., Быков И.В., Шестопалова М.С., Мочалов К.Е. Усиление комбинационного рассеяния металлическими микросферами Квантовая электроника, 53, 10, 813-820 (год публикации - 2024)

7. Сарычев А.К., Иванов А.В., Быков И.В., Шестопалова М.С., Коржов Д.С., Смык А.Ф., Шурыгин А.В., Басманов Д.В., Мочалов К.Е. Плазмонный резонанс в металлической нанооболочке и комбинационное рассеяние в микрообъектах Квантовая электроника, 54, 7, 450-455 (год публикации - 2024)

8. Сарычев А.К., Иванов А.В., Бергман Д., Фан Р., Смык А.Ф. PLASMON ZEBRA RESONANCES AND NANOPAINTING Cовременная электродинамика, 5, 13, 26-36 (год публикации - 2024)
10.24412/2949-0553-2024-513-25-36

9. Иванов А.В., Быков И.В., Барбийон Г., Мочалов К.Е., Коржов Д.С., Ковалев А., Смык А.Ф., Шурыгин А.В., Сарычев А.К. Plasmon localization and field enhancement in flexible metasurfaces Physical Review Applied, 22, 064064 (год публикации - 2024)
10.1103/PhysRevApplied.22.064064

10. Сарычев А.К., Иванов А.В., Быков И.В., Шестопалова М.С., Мочалов К.Е. Surface-Enhanced Raman Scattering in Metal Microspheres Bulletin of the Lebedev Physics Institute, 50, 13, S1492-S1503 (год публикации - 2023)
10.3103/S106833562360242X

11. Сарычев А.К., Иванов А.В., Быков И.В., Мочалов К.Е., Шестопалова М.С., Олейников В.А. Confined Surface-Enhanced Raman Scattering for Bio-objects Detection IEEE (год публикации - 2024)
10.1109/ICLO59702.2024.10624321

12. Золотов Д.А., Дьячкова И.Г., Асадчиков В.Е., Прусаков К.А., Басманов Д.В., Хмеленин Д.Н., Жигалина О.М., Лабис В.В. Особенности морфологии и состава камней в организме человека при исследовании механизмов их образования ПОВЕРХНОСТЬ. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, Vol. 19, No. 3, pp. 640–646 (год публикации - 2025)
10.1134/S1027451025700946

13. Сарычев А.К., Иванов А.В., Быков И.В., Шестопалова М.С., Мочалов К.Е., Коржов Д.С., Смык А.Ф., Шурыгин А.В., Басманов Д.В. Плазмонный резонанс в металлической нанооболочке и комбинационное рассеяние в биообъектах Международный семинар по волоконным лазерам, 139-140 (год публикации - 2024)
DOI:10.31868/RFL.2024.139-140

14. Иванов А.В., Сарычев А.К. Усиление излучения диполя металлической оболочкой ФОТОН-ЭКСПРЕСС, 1, 193, 7-9 (год публикации - 2024)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В проекте разработана точно решаемая электродинамическая модель эффекта гигантского комбинационного рассеяния (ГКР). Развита аналитическая теория плазмонного резонанса в микрообъектах, покрытых металлическими наношляпками, нанесенными на исследуемые микрообъекты. Теория базируется на разложении Ми по векторным «полусферическим» гармоникам электромагнитного (ЭМ) поля, возникающего при плазмоне резонансе. Резонансное поле приводит к усилению комбинационного рассеяния (КР) в микрообъектах, покрытых наношляпками. ЭМ поле КР возбуждает вторичные плазмонные колебания в металлической наношляпке. Плазмонное ЭМ поле также раскладывается по «полусферическим» собственным функциям. Электромагнитный механизм усиления ГКР можно исследовать качественно и количественно в разработанной в проекте точно решаемой модели. Теоретические результаты согласуются с нашим экспериментом по ГКР в полистирольных сферах, частично покрытых нанослоем серебра (наношляпками), которые служат моделью типичных биообъектов. Разрабатывается квантовавшая теория возбуждения молекул за счет туннелирования плазмонных электронов через нано-прослойку между металлическими наночастицами. Плазмонные туннельные переходы представляют собой уникальную систему, в которой комбинационное излучение света происходит посредством взаимодействия между туннелирующими электронами, плазмонными полями, и молекулами изучаемого вещества. «Сечение» взаимодействия изучаемых молекул с туннелирующими электронами на несколько порядков больше чем с ЭМ полем. Этот эффект может приводить к существенному усилению ГКР. Мы полагаем что такое аномальное ГКР наблюдается в наших экспериментах с микрообъектами на которые нанесены наношляпки серебра. Разработана простая аналитическая теория для плазмонных резонансов в системе тонких периодических металлических полосок и пластин. В частности, плазмонный резонанс аналитически вычисляется для системы параллельных металлических полос, которую мы назвали плазмонной зеброй (ПЗ). Частоты плазмонных резонансов соответствуют максимумам отражательной способности ПЗ. Предложена эквивалентная схема ПЗ в которой электрический ток течет поперек металлических нанополосок, которые соединены через меж-полосковую электрическую емкость Эффективные параметры самих нанополосок находятся из решения уравнений Максвелла для поверхностных плазмонов. Эквивалентная схема позволяет находить распределение тока и локального электрического поля в металлических нанополосках. Максимальное электрическое поле может на три порядка превосходить поле, падающей ЭМ волны На основе эффективных параметров рассчитывался коэффициент отражения как функция частоты падающего света. Максимум отражения света соответствует наибольшей величине локального электрического поля. Мы используем ПЗ для усиления комбинационного рассеяния, то есть для получения эффекта ГКР. Для получения максимального эффекта цвет ПЗ в отраженном естественном свете должен соответствовать длине волны лазера, который используется для возбуждения ГКР. Разработана компьютерная модель излучающего электрического диполя, помещенного внутри металлической сферы, полусферы, наношляпки. Модель качественно описывает усиление сигнала ГКР от глобул белков и других микрообъектов, покрытых тонкой серебряной пленкой. Расчеты позволяют оценить изменение сигнала ГКР в зависимости от толщины нанослоя металла, нанесенного на поверхность агрегата, образованного молекулами белка. Разработан дизайн и выполнена оптимизация параметров метаповерхностей из тонкого поликарбоната с металлическим нанослоем. Методом голографической интерференционной литографии изготовлены новые метаматериалы – метаповерхности с металлическим нанослоем. Исследован эффект локализации плазмонов и локального усиления поля в гибкой метаповерхности из модулированной поликарбонатной подложки, покрытой тонкой серебряной пленкой. Локализация оптического возбуждения экспериментально наблюдается с помощью сканирующей оптической микроскопии ближнего поля (SNOM) в субволновых областях метаповерхности с регулярным открытым резонатором. Обнаружено усиление спектров комбинационного рассеяния от полистирольных единичных микросфер (МС), осажденных на гладкую серебряную поверхность. Мы полагаем, что усиление ГКР происходит вследствие усиления ЭМ поля в нанощели (нанозазоре) между МС и металлической поверхностью. В рамках работы по осаждению биологических агентов на сенсорный элемент, отработана общепринятая процедура осаждения вирусов на слюду, предполагающая, что отрицательно заряженная поверхность слюды должна быть покрыта специальным буферным слоем, меняющим заряд поверхности на положительный, чтобы за этот буферный слой вирусы могли зацепиться с помощью поверхностных белков, на краю которых имеются не скомпенсированные отрицательные заряды. Спроектированы и изготовлены прототипы прецизионных распределителей потоков для микрофлюидного картриджа и прототипы микрофлюидных картриджей на их основе. Слои картриджа изготовлены из листовых пластиков, адгезивов и эластомеров. Эти детали изготавливались методом лазерной абляции с помощью лазерного станка с компьютерным управлением. Был разработан алгоритм процессирования, при котором биологический образец после процессирования в микрофлюидном картридже наносится на ГКР-активную структуру. Был спроектирован экспериментальный стенд, содержащий ключевые элементы автоматизированного анализатора, предназначенного для проведения анализа с помощью тест-систем на основе комбинационного рассеяния света и ГКР. Подобраны отдельные элементы экспериментального стенда, в том числе, моторизованная система перемещения дозатора и оптической системы с программным управлением, направленной на фокусировку лазерного луча. В основе конструкции разработанного экспериментального стенда находится коммерчески доступная жесткая рама, представляющая собой трехкоординатный манипулятор портального типа. На манипуляторе закрепляются электронный дозатор и оптический блок. В поле манипулятора расположены штативы и термошейкер. Для перемещения манипулятора используются шаговые двигатели с энкодерами, и концевыми выключателями. Вместе с платой контроллера и управляющим ПК эта система образует манипулятор с числовым программным управление (ЧПУ), которая позволяет программировать различные сценарии перемещения и осуществляет точность позиционирования не хуже чем 0,1 мм. Спроектированный экспериментальный стенд подразумевает возможность процессирования биологического образца в лунках микропланшетов или пробирок и последующее внесение образца как в микрофлюидный чип или картридж, так и на специализированную ГКР-активную подложку для получения спектров.

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
При разработке плазмонных нанорезонаторов важно знать максимальную величину локального электрического поля. Предложена аналитическая модель плазмонов, возбуждаемых в нанозазоре между металлическим наноцилиндром и металлической поверхностью для различных металлов. Возникающие гигантские локальные электрические поля приводят к гигантскому комбинационному рассеянию (ГКР). Найдены условия резонанса, при которых возможно достижение предела электромагнитного поля как внутри, так и вблизи зазора. Максимальное электрическое поле Emax достигается, когда падающий свет находился в резонансе с модой плазмонного зазора, и может быть выражено через падающее поле E0 как |Emax/E0| ≈ |EpsM|^3 Im(EpsM), где EpsM диэлектрическая проницаемость металла. Этот предел максимального поля, достижимого в нанозазоре. Разработана аналитическая модель плазмонов, возбуждаемых в металлических резонаторах, наполненных исследуемыми молекулами. Аналитическая модель может быть использована для анализа ГКР от молекул в различных замкнутых металлических нано оболочках. Выполнен «точный» расчет электромагнитного поля в сферической металлической нанооболочке путем суммирования Ми разложения электромагнитного поля по векторным сферическим гармоникам. Выполнено детальное компьютерное моделирование ГКР от молекул, заключённых во внутри металлической нанооболочки. Приведено экспериментальное исследование ГКР в полистирольных наносферах, покрытых нанослоем серебра. Сигнал ГКР от таких наносфер, моделирует усиление сигнала КР от визикул и вирионов, покрытых нанослоем серебра. Установлено, что в диапазоне мощностей 2,5–10 мкВт интегральная интенсивность спектра линейно возрастала, тогда как при увеличении мощности до 20 мкВт происходило скачкообразное увеличением коэффициента усиления в 10^6 раз. Феномен активации возможно связан с локальной термомодификацией интерфейса «анализируемый объект - металлическое покрытие», что улучшает доступ к локализованным полям и обеспечивает формирование устойчивого резонансного состояния. Можно предположить, что при «вплавлении» серебреной оболочки в полистирольную сферу свободные «серебренные» электроны проникают в полистирол и непосредственно взаимодействуют с молекулами вещества. Мы продолжаем теоретически и экспериментально исследовать обнаруженное явление. Разработан дизайн и выполнена оптимизация параметров гибких метаповерхностей (ГМП) из тонкого поликарбоната с металлическим нанослоем. Методом голографической интерференционной литографии изготовлены метаповерхности с металлическим нанослоем. Исследован эффект локализации плазмонов и локального усиления поля. Локализация оптического возбуждения экспериментально наблюдается с помощью сканирующей оптической микроскопии ближнего поля в субволновых областях метаповерхности. Разработанные ГМП позволили получить сигналы ГКР от отдельных экзосом, которые представляют собой липидные нано-капли. Экзосомы непрерывно образуются живыми клетками для межклеточной коммуникации. Они включают в себя молекулы белка, РНК, ДНК, и участвуют в регуляции как нормальных, так и патологических процессов в живой клетке. Выделяемые раковыми клетками экзосомы интенсивно изучаются, поскольку являются перспективными средствами для диагностики онкологических заболеваний. Период модуляции разработанной соответствуют размерам экзосом. Важным преимуществом разработанной плазмонной ГМП, является ее пространственная комплементарность экзосомам и другим микроскопическим биообъектам. ГМП позволяет различать одиночные экзосомы HEK293T нанесенные на эту высокоразвитую метаповерхность. Разработан метод лазерной активации ГКР-активных пятен внутри тонкого слоя серебра, расположенных квадратной решеткой с периодом 50 мкм. Активация достигается лазерной абляцией серебреной пленки с образованием наноструктурированной поверхности. Этот подход позволяет генерировать in situ свежие, высокоэффективные ГКР положки непосредственно перед осаждением аналита. Предел обнаружения (LOD) для этих систем оцененивается ∼0,15 мкМ, что достаточно для быстрого (5 с на спектр) обнаружения и последующего ГКР анализа отдельных внеклеточных везикул и их кластеров. Разработана микрофлюидная система позволяющая проводить автоматизированную пробоподготовку биологических проб непосредственно перед выполнение спектральных измерений методом спектроскопии ГКР с использованием описанных ранее ГКР-актвных субстратов. С помощью программы 3D моделирования COMSOL была разработана топология производства микрофлюидных каналов и микроэлектродов микрофлюидного чипа и набора микроэлектродов. Была разработана методика сортировки везикулоподобных (вирусы экзосомы) биообъектов. Был создан прототип микрофлюидного чипа с системой каналов, обеспечивающих сортировку везикулоподобных биообъектов с заданными характеристиками, на основании технологии оптической литографии. Shestopalova M., Korzhov D., Afanasyev K., Ivanov A., Bykov I., Sarychev A., Basmanov D., Il’in A., Mochalov K. // Laser-activated microfluidic SERS substrates // ACS Sensors. – 2025. ACCEPTED. Q1 IF 9.1 Mochalov K., Korzhov D., Shestopalova M., Ivanov A., Afanasev K., Smyk A., Shurygin A., Sarychev A.K. Single exosome SERS detection by means of a flexible metasurface // Biosensors. – 2025. ACCEPTED. Q1 IF 5.6 https://link.springer.com/article/10.1007/s11082-025-08473-w https://doi.org/10.1134/S1063778825090649 https://doi.org/10.31868/RFL.2024.139-140 https://doi.org/10.20953/1817-7646-2025-4-65-71 https://doi.org/10.1134/S1027451025700946 https://doi.org/10.36233/0372-9311-662 https://quantum-electronics.ru/wp-content/uploads/2024/07/450.pdf https://quantum-electronics.ru/wp-content/uploads/2023/10/0813.pdf https://doi.org/10.1109/ICLO59702.2024.10624321 https://doi.org/10.24412/2949-0553-2024-513-25-36 https://doi.org/10.31868/RFL.2024.139-140 https://doi.org/10.1103/PhysRevApplied.22.064064 https://doi.org/10.24412/2308-6920-2023-6-115-115 https://doi.org/10.3390/app132312882 https://doi.org/10.1109/DD58728.2023.10325828 https://doi.org/10.15593/2411-4375/2023.7.03 https://doi.org/10.3103/S106833562360242X https://elibrary.ru/item.asp?id=80561164 https://doi.org/10.1109/DD58728.2023.10325816 https://elibrary.ru/item.asp?id=83181323

Публикации

Возможность практического использования результатов
Экзосомы представляют собой липидные нано-капли, которые непрерывно образуются живыми клетками для межклеточной коммуникации. Они включают в себя молекулы белка, РНК, ДНК, и участвуют в регуляции как нормальных, так и патологических процессов в живой клетке. Выделяемые раковыми клетками экзосомы интенсивно изучаются, поскольку являются перспективными средствами для диагностики онкологических заболеваний. В работе одиночные экзосомы обнаруживаются методом гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) благодаря аккумуляции электромагнитного поля на специально разработанной гибкой метаповерхности. Метаповерхность представляет собой дважды модулированная серебряную нанопленку, нанесенную на тонкую гибкую пластиковую пленку. Периоды модуляции соответствуют размерам экзосом. Важным преимуществом разработанной плазмонной метаповерхности, является ее пространственная комплементарность экзосомам и другим микроскопическим биообъектам. Метаповерхность используется для получения спектров ГКР которые позволяют различать одиночные экзосомы HEK293T нанесенные на эту высокоразвитую метаповерхность. Полученные результаты могут быть использованы для получения ГКР сигнатур экзосом выделяемых различными линиями раковых клеток и последующей диагностики онкологических заболеваний используя жидкую биопсию. Важно подчеркнуть, что такая ГКР диагностика онкологических заболеваний активно развивается зарубежном. Число работ по изучению раковых экзосом методом ГКР удваивается каждые два года. Результаты проекта лягут в основу создания ГКР-биосенсоров для медицинской диагностики (Point-of-сare) для мониторинга в режиме реального времени различных биомаркеров. В зависимости от области практического применения ГКР биосенсоры могут быть адапатированы в медицинской диагностике (Point-of-сare) для мониторинга в режиме реального времени различных биомаркеров, таких как глюкоза и гликированные белки в крови, обеспечивающих специфическую диагностику сахарного диабета, почечной недостаточности, гипотиреоза; сердечно-сосудистых маркеров для диагностики острого инфаркта миокарда; маркеров нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона; опухолевых маркеров; гормона эстрадиола E2 для клинической диагностики преждевременного полового созревания и других; определения микро- и нанопластика в биологических жидкостях и тканях, сосудах.