Генетическая модификация путей синтеза липополисахарида у Escherichia coli для получения продуцентов рекомбинантных белков и плазмид со сниженным содержанием эндотоксинов.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-24-00080

НазваниеГенетическая модификация путей синтеза липополисахарида у Escherichia coli для получения продуцентов рекомбинантных белков и плазмид со сниженным содержанием эндотоксинов.

Руководитель Харлампиева Дарья Дмитриевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства" , г Москва

Конкурс №78 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые слова Escherichia coli, липополисахарид, эндотоксин, липид А, эндотоксин, рекомбинантный белок, плазмида

Код ГРНТИ62.37.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Кишечная палочка Escherichia coli широко используется в лабораторных исследованиях, а также в биофармацевтической промышленности как эффективный продуцент рекомбинантных белков, а также ДНК-векторов. Однако препараты белков и плазмид, выделенные из E. coli, загрязнены липополисахаридом (ЛПС) – основным компонентом внешней мембраны. ЛПС, известный также как эндотоксин, оказывает пирогенное действие на организм млекопитающих, в том числе человека, вызывает септический шок и может приводить к смертельному исходу. При воздействии на культуру эукариотических клеток ЛПС вызывает провоспалительное действие. Таким образом, при проведении фундаментальных исследований бывает сложно отличить действие исследуемого белка от действия примеси эндотоксина. Поэтому крайне важно проводить дополнительную очистку от ЛПС препаратов белков и ДНК-векторов, выделенных из E. coli. Однако к настоящему времени не существует общепринятого эффективного протокола удаления эндотоксина из проб. Как правило, очистка от ЛПС является многоступенчатой, неполной, и приводит к значительной потере целевого продукта. Альтернативным подходом является получение E. coli с ЛПС, модифицированным таким образом, чтобы он либо терял способность связываться с рецепторами на клетках млекопитающих и не оказывал пирогенного действия, либо же за счет изменения химической структуры, а следовательно, свойств, легко удалялся при стандартных стадиях очистки рекомбинантных белков и плазмид. Именно на создание таких штаммов направлен данный проект. В ходе проекта планируется получить штаммы, пригодные для наработки препаратов рекомбинантных белков и плазмид со сниженным содержанием эндотоксина или вовсе от него свободным. Получение таких штаммов будет способствовать облегчению очистки от эндотоксина терапевтических препаратов в биофармацевтической промышленности.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Бобровский П.А., Харлампиева Д.Д., Кириллин С.А., Бровина К.А., Графская Е.Н., Лазарев В.Н., Манувера В.А. Повышение уровня синтеза белка YciM позволяет снизить загрязнение эндотоксинами рекомбинантных белков, получаемых в Escherichia сoli Биохимия, БИОХИМИЯ, 2023, том 88, вып. 9, с.1597-1605 (год публикации - 2023)
10.1134/S0006297923090110

2. Харлампиева Д.Д., Бобровский П.А., Графская Е.Н., Лазарев В.Н., Манувера В.А. Escherichia coli strain for plasmid DNA production with low endotoxin level. Applied Biochemistry and Microbiology, Vol. 60, No. 6, pp. 1147–1152. (год публикации - 2024)
10.1134/S0003683824604517

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Плазмидная ДНК (пДНК) является одним из возможных типов векторов, применяемых в генной терапии. Чаще всего для продукции пДНК используется бактерия Escherichia coli, наружный слой внешней мембраны которой состоит преимущественно из липополисахаридов. Липополисахариды являются сильными эндотоксинами, их примесь в фармакологических субстанциях является крайне нежелательной. Одним из способов избавиться от примесей эндотоксинов является нокаут генов пути биосинтеза липополисахаридов. В качестве объекта для геномного редактирования нами был выбран штамм E. coli SCS 110. Он отличается отсутствием dam и dcm метилирования ДНК, что является крайне важным для производства генно-терапевтических препаратов, а также дефектом в гене endA, продукт которого – эндонуклеаза-1 – вызывает деградацию двухцепочечной ДНК, в том числе и пДНК. С помощью технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 была получена мутантная форма штамма E. coli SCS110 в результате нокаута генов kdsD, gutQ, lpxM, lpxL, lpxP, pagP и eptA. В результате загрязнение липополисахаридами образцов пДНК, выделенных разными методами, широко используемыми в лабораторной практике, достоверно снизилось от 19 до 295 раз. Также использование для продукции плазмид полученного нами штамма SCS 110 (8m) с нокаутом ряда генов пути биосинтеза ЛПС позволяет получать образцы плазмидной ДНК методом щелочного лизиса с использованием недорогих и общедоступных реактивов с таким же количеством эндотоксинов, как в образцах пДНК, выделенных с помощью коммерческого набора Qiagen plasmid maxi kit.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Результаты проведенных исследований показывают, что в препаратах рекомбинантного белка и плазмидной ДНК, выделенных из полученных в данной работе штаммов E. coli c нокаутированными генами пути биосинтаза липополисахаридов, снижено содержание эндотоксинов. Использование таких штаммов может способствовать облегчению очистки от эндотоксина терапевтических препаратов в биофармацевтической промышленности. Однако требуется проведение дополнительных работ, направленных на увеличение скорости роста полученных штаммов.