Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В отчётном году были проведены завершающие эксперименты, а также построена и исследована стохастическая модель, учитывающая полученные экспериментальные данные. В экспериментальной части работ проведены эксперименты по трансфекции плазмидой с конструктом LINE-1-EGFP клеток линии HEK-293, полученной из почек эмбриона человека, и найдена стратегия получения стабильного флуоресцентного сигнала в популяции клеток в результате селекции на пуромицине и сортинга по сигналу EGFP. Показана низкая эффективность трансфекции клеток раковых линий MCF-7, Hs578T и A549. Получены экспериментальные данные по транспозиции (интенсивность экспрессии EGFP в экспериментах с трансфекцией плазмидой с конструктом LINE-1-EGFP) в клетках линии HEK-293, а также ПЦР-данные по динамике экспрессии транспозонов в клетках линии MCF-7. Получены экспериментальные данные по динамике концентрации АТФ в клетках MCF-7 и HEK-293. Данные по АТФ получены в нормальных условиях, после трансфекции плазмидой LINE-1-EGFP и после обработки 5-азацитидином. В результате экспериментальных работ показано, что обработка азацитидином ведёт к росту количества АТФ, причём как в интактных, так и в трансфицированных клетках. При этом трансфицированные клетки HEK-293 устойчиво демонстрируют более высокий уровень АТФ по сравнению с интактными для идентичных условий и времён измерения. Схожий эффект повышения уровня АТФ после трансфекции и обработки азацитидином наблюдался в клетках MCF-7. В теоретической части работ разработана стохастическая модель динамики энергозатрат с учётом активности мобильных элементов, применимая для симуляции популяции клеток (популяционная модель). Модель построена на основе метода стохастического моделирования Гиллеспи с ускорением вычислений с помощью метода tau-leaping. В модели реализован алгоритм деления клеток с динамическим случайным распределением всех молекулярных агентов из материнской в дочерние клетки. Программы, реализующие модель, выложены на web-странице: https://github.com/SeriySamuray/TE_model. Проведена калибровка стохастической модели по полученным экспериментальным данным, в которой значения свободных транспозон-ассоциированных параметров оптимизировались так, чтобы средние уровни АТФ в стационаре соответствовали экспериментально измеренным значениям для двух условий — MCF-7 в нормальных условиях и MCF-7 после обработки 5-азацитидином (деметилированная ДНК). В рамках калиброванной стохастической модели рассчитаны стационарные распределения молекулярных агентов, включая энергетические ресурсы (концентрации АТФ), в популяции клеток в «нормальных» условиях и в условиях деметилирования ДНК в клетках MCF-7. Показана согласованность решений в детерминистской модели (модель для «усреднённой» клетки) и в среднем в популяции согласно стохастической модели. Новых стохастических эффектов, связанных с влиянием транспозонов на энергетику на уровне популяции, не выявлено. Показана низкая вариабельность числа молекул всех переменных в модели. Проведено исследование параметрической чувствительности стохастической модели в окрестности оптимизированных параметров, в результате которого показано, что, так же как в детерминистской модели, константы скорости деактивации и максимальная скорость транскрипции транспозонов показывают максимальный отклик уровня АТФ к их возмущению среди всех транспозон-ассоциированных параметров. В отличие от детерминистской модели, уровень АТФ в калиброванной стохастической модели значительно более чувствителен к возмущению этих параметров. Проведены расчёты в стохастической модели с оптимизированными значениями параметров, в результате которых показано, что распределения расходов энергии по клеточным процессам практически совпадают в моделях, соответствующих нормальным условиям и условиям деметилированной ДНК. Показана значительная устойчивость энергетического баланса в обоих условиях к изменению начальных количеств мобильных элементов LINE-1 и SINE в геноме, а также максимальный отклик средней концентрации АТФ в популяции к возмущению констант скорости деактивации LINE-1 и SINE. На основе полученных результатов были сформулированы возможные пути практической реализации результатов моделирования, которые могут состоять в применении сформулированных сценариев влияния на энергетический баланс в клетках с помощью транспозон-ассоциированных параметров. Обнаруженный в эксперименте рост количества АТФ в трансфицированных клетках по сравнению с интактными позволяет сделать предположение о дополнительном непрямом влиянии активизировавшихся транспозонов на энергетику, в результате которого проявляется обратный эффект сохранения энергетических ресурсов. Полученные экспериментальные результаты позволяют предположить, что достичь энергетического истощения в раковых клетках нельзя только за счёт увеличения числа активных транспозонов, и требуются дополнительные модификации транспозон-ассоциированных параметров. В результате моделирования показано, что интуитивно наиболее привлекательный и простой с точки зрения практической реализации сценарий, связанный с увеличением числа активных LINE-1 и SINE в геноме, приводит только к кратковременному уменьшению концентрации АТФ. Представляется интересным экспериментальная проверка того, насколько такие временные колебания в энергии сказываются на судьбе клетки. Также выглядит перспективным поиск методов «пролонгации» таких состояний. Результаты моделирования предлагают в качестве такого метода пролонгации модификацию механизмов сайленсинга транспозонов в геноме (связаны с константой деактивации транспозонов в модели) и модификацию скорости транскрипции LINE-1 и SINE. Сценарии, связанные с достаточным изменением скоростей этих процессов, также должны приводить к значительному снижению концентрации АТФ в стационарных условиях.