Онкогенные свойства Mycoplasma hominis в качестве инфекционного агента при раке простаты.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-24-00189

НазваниеОнкогенные свойства Mycoplasma hominis в качестве инфекционного агента при раке простаты.

Руководитель Галямина Мария Алексеевна,

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства" , г Москва

Конкурс №78 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-205 - Клеточная биология, цитология, гистология

Ключевые слова Mycoplasma hominis, хроническая микоплазменная инфекция, рак предстательной железы, бактериальные онкогены, противоопухолевые препараты, антиметаболиты.

Код ГРНТИ76.03.43

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
К настоящему времени получено достаточное количество данных, подтверждающих тесную связь между злокачественными новообразованиями и хроническим воспалением в результате персистирующей бактериальной инфекции. Появляется все больше исследований, доказывающих этиологическую роль бактериальных факторов, способствующей переходу инфицированной ткани к злокачественной опухоли. Причинно-следственная связь между различными типами рака и бактериями (Streptococcus bovis, Salmonella typhi, Chlamydia pneumoniae, Bartonellaи Helicobacter pylori) убедительно доказана. Получено достаточное количество данных, подтверждающих связь между микоплазмами и развитием злокачественных новообразований. Редуцированный геном, очень маленький размер клетки, отсутствие клеточной стенки и высокий адаптивный потенциал позволяют этим бактериям легко прикрепляться и проникать внутрь эукариотических клеток и вызывать хроническое воспаление. Mycoplasma pneumoniae была одним из первых видов микоплазм, подозреваемых в связи с лейкозом человека еще в 1960-х годах. Позже во многих исследованиях была показана связь между микоплазменной инфекцией и раками предстательной железы (РПЖ), желудка, пищевода, легких и молочной железы. Предложены некоторые молекулярные механизмы, которые индуцируют хромосомную нестабильность и злокачественные трансформации, тем самым способствуя иммортализации, повышенной миграции и инвазии опухолевых клеток. Методом РТ-ПЦР в образцах, полученных от пациентов с РПЖ, было продемонстрировано присутствие Ureaplasma urealyticum (1 %), Mycoplasma genitalium (6 %) и Mycoplasma hominis (M. hominis) (15 %). Наличие M. hominis коррелировало с тяжестью диагноза. Несмотря на полученные данные, роль M. hominis в поддержании опухоли остается неизученной. Данный проект направлен на исследование онкогенных свойств M. hominis в качестве инфекционного агента при РПЖ. Для этого будет использована клеточная линия рака простаты VCaP и линия здоровых клеток HaCaT. Мы планируем провести масштабный сравнительный анализ как клеток линий VCaP и HaCaT, так и клеток M. hominis до и после хронической инфекции на уровне протеома и транскриптома. Будет проведен количественный анализ представленности белков методами дифференциального 2Д электрофореза и ВЭЖХ-МС, а также анализ фосфопротеома. Методом РТ-ПЦР будет проведена оценка экспрессии известных онкогенов, факторов роста, супрессоров опухоли, а также генов дифференциальных белков, обнаруженных нами в результате протеомного анализа. Полученные данные позволят определить индуцируемые микоплазмой клеточные пути и регуляторные каскады в эукариотических линиях, которые связаны с канцерогенной и антиапоптотической активностью. Наряду с этим будет оценены морфология и выживаемость эукариотических клеток после инфекции, а также определены адгезивно-инвазивный потенциал, морфология колоний и степень устойчивость к антибиотикам M. hominis после хронической инфекции. Ранее было обнаружено, что микоплазменные инфекции снижают эффективность противоопухолевых препаратов, относящихся к классу антиметаболитов - аналогов нуклеозидов. Показано, что биологическая активность таких соединений, как флоксиридин, трифтортимидин и другие аналоги тимидина, была снижена до140 раз в инфицированных микоплазмой клеточных культурах. Мы планируем изучить механизмы инактивации действия антиметаболитов при микоплазменной инфекции. Для этого мы будем использовать мутанты M. hominis со сверхэкспрессией и нокаутом гена тимдинфосфорилазы DeoA, ключевого фермента катаболизма нуклеозидов. Всесторонний сравнительный анализ на уровне протеома и транскриптома зараженных M. hominis 2 различных по происхождению клеточных линий будет проведен нами впервые. Изучение онкогенных свойств M. hominis в качестве инфекционного агента при РПЖ может стать важным прорывом в изучении его патогенеза. Полученные результаты помогут сделать правильный выбор при лечении опухолей, инфицированных микоплазмой.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Галямина М.А., Побегуц О.В., Горбачев А.Ю. Роль микоплазм в качестве инфекционного агента при канцерогенезе. Успехи молекулярной онкологии, т.10, №3, стр. 36-49 (год публикации - 2023)
10.17650/2313-805X-2023-10-3-36-49

2. Галямина М.А., Сикамов К.В., Уразаева Д.Р., Авшалумов А.С., Михайлычева М.В., Побегуц О.В., Горбачев А.Ю. Корреляция между фенотипом колоний и аминокислотной последовательностью вариабельного антигена Vaa у клинических изолятов Mycoplasma hominis. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины (год публикации - 2023)

3. Галямина М.А., Сикамов К.В., Уразаева Д.Р., Авшалумов А.С., Михайлычева М.В., Бабенко В.В., Смирнов И.П., Побегуц О.В., Горбачев А.Ю. ОСОБЕННОСТИ ФЕНОТИПИЧЕСКОЙ АДАПТАЦИИ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ M. HOMINIS, ВЫЯВЛЕННЫЕ МЕТОДОМ ПРОТЕОГЕНОМНОГО ПРОФИЛИРОВАНИЯ. Молекулярная диагностика 2023. Сборник трудов., с 266-267 (год публикации - 2023)

4. Побегуц О.В., Галямина М.А., Сикамов К.В., Уразаева Д.Р., Авшалумов А.С., Михайлычева М.В.,Бабенко В.В., Смирнов И.П., Горбачев А.Ю. Unraveling the adaptive strategies of Mycoplasma hominis through proteogenomic profiling of clinical isolates Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2024 May 2;14:1398706 (год публикации - 2024)
10.3389/fcimb.2024.1398706

5. М.А. Галямина, О.В. Побегуц, М.Е. Богомякова, И.П. Смирнов, К.В. Сикамов, А.Ю. Горбачев Mycoplasma hominis в качестве инфекционного агента линии карциномы простаты человека LNCaP Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2024 г., Том 178, № 11 НОЯБРЬ, 599-604 (год публикации - 2024)
10.47056/0365-9615-2024-178-11-599-604

6. Галямина М.А., Побегуц О.В., Сикамов К.В., Смирнов И.П., Богомякова М.Е., Горбачев А.Ю. Сравнительный анализ онкогенных свойств Mycoplasma hominis на модели хронической инфекции эукариотической клетки Сборник тезисов. МЕЖДУНАРОДНЫЙ КОНГРЕСС «VIII Съ е з д Вави л овск о г о о б щ ества г е н е т и к ов и се л е к ц и о н е р ов , п освя щ е н н ы й 300‑л е т и ю р осси йск о й н а у к и и в ы сш е й ш к о л ы » Саратов 14–19 и ю н я 2024 г о д а, Том 1, стр. 433 (год публикации - 2024)

7. К.В. Сикамов, О.В. Побегуц, М.А. Галямина, Д.Р. Уразаева, А.С. Авшалумов, М.В. Михайлычева, В.В. Бабенко, И.П. Смирнов, А.Ю. Горбачев Выживание в организме хозяина: протеогеномное исследование адаптивных свойств клинических изолятов Mycoplasma hominis Сборник тезисов. III МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ «Сохранение и преумножение генетических ресурсов микроорганизмов» г. Санкт-Петербург, 2024 , стр.59 (год публикации - 2024)

8. Сикамов К.В., Побегуц О.В., Уразаева Д.Р., Авшалумов А.С., Михайлычева М.В., Бабенко В.В., Галямина М.А., Горбачев А.Ю. Адаптивные свойства клинических изолятов M. hominis К 300-ЛЕТИЮ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК XXXVI МЕЖДУНАРОДНАЯ ЗИМНЯЯ МОЛОДЁЖНАЯ НАУЧНАЯ ШКОЛА "ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ" Москва, 7-9 февраля 2024 г. Сборник тезисов, 9.29., стр 156 (год публикации - 2024)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Сравнительный количественный анализ фосфопротеома раковой клеточной линии LNCaP и здоровой клеточной линии HaCaT до и после заражения M. hominis с помощью тандемной масс-спектрометрии (TMT) позволил определить более 1400 фосфориллированных белков. Определены сигнальные пути, которые активируются в зараженных клетках. Большинство идентифицированных фосфобелков локализуются в ядре. Показано, что для обеих клеточных линий наиболее представленными являются группы белков, участвующие в сплайсинге РНК, клеточном сигналинге, организации хроматина, фолдинга белков, регуляции. В отличие от LNCaP в зараженных клетках HaCaT увеличивается представленность фосфобелков, участвующих в организации рибосом, процессинге РНК и транскрипции. Большое количество компонентов сплайосомы, факторов, контролирующих сплайсинг и отвечающих за сборку сплайосомы указывает на то, что при заражении микоплазмой в обеих клеточных линиях активируется как конститутивный, так и альтернативный сплайсинг, что позволяет расширять спектр экспрессируемых белков, и тем самым расширять или изменять их функциональные возможности. Большая доля фосфориллированных белков, участвующих в организации структуры хромосомы (гистоны, шапероны и ферменты, модифицирующие гистоны (в частности, деацетилазы гистонов, которые тормозят транскрипцию генов)) свидетельствуют о том, что конформационные изменения хроматина играют одну из основных ролей в регуляции экспрессии генов как в раковых, так и здоровых клетках в ответ на инфицирование микоплазмой. Функциональный анализ фосфориллированных белков-регуляторов и транскрипционных факторов показал, что для обеих клеточных линий при заражении активируется система подавления апоптоза, регуляция сплайсинга РНК и регуляция транскрипции. В отличие от LNCaP, при заражении HaCaT активируются пути, регулирующие клеточный иммунитет и защитные реакции в ответ на инфекцию. Эти данные согласуются со сравнительным протеомным анализом, выполненным нами в первый год проекта, где мы показали, что в отличие от раковой линии LNCaP, здоровые кераноциты HaCaT включают мощный иммунный клеточный ответ на инфицирование микоплазмой, особенно в первые дни инфекции. Анализ влияния M. hominis на действие двух антиметаболитов - гемцитабина (антагониста пиримидинов) и меркаптопурина (антагониста пуринов) на клетки LNCaP, инфицированых диким типом M. hominis, а также мутантом со сверхэкспрессией гена deoA (МНО_deoA) и мутантом, нокаутным по этому гену (МНО_∆deoA), показал, что зараженные микоплазмой клетки LNCaP становятся более устойчивыми к гемцитабину и это устойчивость увеличивается при заражении мутантом МНО_deoA. При этом жизнеспособность LNCaP, зараженных мутантом МНО_∆deoA была такой же, что и контрольные клетки. Показано, что гемцитабин изменяет морфологию только контрольных клеток LNCaP и зараженных мутантом МНО_∆deoA. Инфицирование LNCaP диким типом M. hominis не влияло на действие меркаптопурина. Мы показали, что инфицирование клеток LNCaP микоплазмой ведет к снижению действия гемцитабина и фермент DeoA микоплазмы может участвовать в процессе деградации этого антиметаболита. Количественный сравнительный анализ представленности белков в клетках LNCaP до и после заражения мутантными штаммами M. hominis со сверхэкспрессией (МНО_deoA) и нокаутом гена deoA (МНО_∆deoA) показал, что при заражении клеток LNCaP мутантами количество дифференциальных белков в пять раз меньше, чем при заражении диким типом. Функциональный анализ белков, уровень которых растет в зараженных клетках показал, что направления изменений похожи для обоих случаев. Наиболее значительными группами белков составляют белки, участвующие в регуляторных каскадах, организации цитоскелета, клеточном иммунитете, деградации внеклеточного матрикса, транспорте, метаболизме и белки протеасомы. В отличие от дикого типа, в случае мутантов мы не увидели такого масштабного роста уровня рибосомальных белков, ферментов энергетического метаболизма и метаболизма липидов. Определены регуляторные белки, уровень которых растет только при заражении LNCaP мутантом МНО_deoA. Они участвуют в активации сигнальных каскадов, связанных с клеточным ростом, выживанием, пролиферацией, подвижностью клеток. Определены регуляторные белки, уровень которых растет только при заражении LNCaP мутантом МНО_∆deoA. Они связаны с регуляцией продукции антибактериальных пептидов, клеточного иммунного ответа, организации хромосомы и апоптоза. Отмечено, что при заражении мутантами растет уровень белков, связанных с иммунным клеточным ответом, чего мы не обнаружили при заражении LNCaP диким типом M. hominis. Функциональный анализ белков, уровень которых снижается при заражении клеток LNCaP мутантами показал, что направления изменений также похожи для обоих случаев. Наиболее значительные группы белков - белки, участвующие в регуляторных каскадах, сплайсинге РНК, РНК-процессинге, протеосомной деградации, биогенезе рибосом, организации цитоскелета и хроматина, репликации. В основном эти направления изменений сходны с тем, что мы наблюдали при заражении LNCaP диким типом M. hominis. Среди регуляторных белков только пять белков-регуляторов были общими для двух случаев зараженных клеток, все они связаны с негативной регуляцией сигнальных путей, связанных с клеточным циклом и адгезией. Уникальными для LNCaP, зараженных MHO_deoA, были регуляторы, связанных с ответом на гипоксию и окислительный стресс, регулирующие альтернативный сплайсинг, апоптоз и клеточный иммунитет. Уникальными для LNCaP, зараженных МНО_∆deoA, были киназы, участвующие в регуляции актинового цитоскелета, миграции клеток, инвазии опухолевых клеток и регуляция транскрипции. Полногеномное секвенирование лабораторного штамма M. hominis H-34 позволило собрать геном в кольцо, он одной кольцевой хромосомы в 757124 п.н. с содержанием GC -26,8%, имеет 609 генов. Обнаружено, что в геноме M. hominis присутствуют два локуса РМ I типа, из них второй имеет между S-субъединицами ген psrA, кодирующий ДНК инвертазу, генерирующую рекомбинантные гены S-субъединиц, обладающих альтернативной ДНК-связывающей специфичностью. Такое большое количество ферментов РМ на маленький геном микоплазмы говорит, что потенциал фазово-переменного метилирования ДНК может служить регуляторным механизмом у M. hominis. Сравнительный анализ последовательности гена vaa (кодирующего основной вариабельный антиген) лабораторного штамма M. hominis Н-34 и семи клинических изолятов, которые формировали на твердом агаре разные фенотипы колоний показал, что фенотип колоний четко соответствует изменениям в последовательности Vaa.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта могут использованы в медицинской практике при лечении пациентов с онкологическими заболеваниями. Мы показали, что микоплазмы, как инфекционные агенты, могут снижать действие антиметаболитов нуклеозидного ряда, используемых для химиотерапии, поскольку могут их активно метаболизировать. При назначении препаратов надо учитывать заражен ли пациент микоплазмами. Необходимо ставить ПЦР-тест на микоплазмы, поскольку чаще всего микоплазменные инфекции проходят безсимптомно. Мы также показали, что микоплазменная инфекция способствует активации регуляторных путей здоровой клетки, способствующих увеличению пролиферации, инвазии, адгезии, т.е. свойствам, приводящим к превращению здоровой клетки в раковую. Поэтому врачам надо будет с вниманием относится к пациентам, инфицированным микоплазмой. Кроме того, поскольку микоплазмы легко проникают и не вызывают гибели эукариотических клеток при инфицировании, а также лекго подвергаются генно-инженерным манипуляциям, их можно использовать в качестве бактериального агента для лечения пациентов с окологическими заболеваниями. Мы показали, что после того, как микоплазма побывала в клетке, она фенотипически меняется и переходит в форму, устойчивую к антибиотикам. Поэтому для лечения микоплазменных инфекции не годятся способы лечения на основе антибиотиков.