Разработка сенсорной системы на основе флуоресцентных золотых нанокластеров для детекции бактериальных клеток в биопленках

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-24-00246

НазваниеРазработка сенсорной системы на основе флуоресцентных золотых нанокластеров для детекции бактериальных клеток в биопленках

Руководитель Евстигнеева Стелла Сергеевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр "Саратовский научный центр Российской академии наук" , Саратовская обл

Конкурс №78 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые слова Золотые нанокластеры, флуоресценция, сенсор, бактерии, биопленки, детекция

Код ГРНТИ34.57.21

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Биопленочные сообщества бактерий встречаются повсеместно и прочно вошли в нашу жизнь, принося как заметную выгоду, так и непоправимый вред. С одной стороны, биопленки участвуют в производстве продуктов питания и напитков, задействованы в очистке почв и сточных вод, защищают растения от фитопатогенной микрофлоры. Однако, с другой стороны, подавляющее число возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных образуют биопленки, тем самым сильно усложняя антимикробную терапию. Существует проблема, связанная с недостатком методик экспресс-детекции бактериальных клеток в составе биопленок, позволяющих дифференцировать грамположительные и грамотрицательные штаммы и определить их локализацию. Представленный проект ориентирован на разработку сенсора на основе флуоресцентных биоорганических золотых нанокластеров, способных детектировать бактерии в составе моновидовых и мультивидовых биопленок. Биоорганические золотые нанокластеры являются перспективной разновидностью флуоресцентных наноматериалов. Они представляют собой супрамолекулярные комплексы, состоящие из счетного количества атомов золота и стабилизирующих их органических молекул. Размер золотых нанокластеров сравним с длиной волны Де Бройля (2-3 нм) и обуславливает проявление ими квантово-размерных эффектов. Данные нанобиоструктуры можно использовать для селективного мечения грамположительных и грамотрицательных бактерий в составе биопленок. Данное решение представляется актуальным по нескольким причинам. Во-первых, их молекулярный размер (от 5 до 15 кДа) и химическая структура позволяют предположить, что различия в строении клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий способствуют избирательному накоплению нанокластеров в клетках определенных типов без применения дополнительных таргетирующих молекул. Во-вторых, бактерии сами способны продуцировать флуоресцентные золотые нанокластеры на клеточных стенках в зависимости от их строения. В-третьих, флуоресцентные нанокластеры обладают рядом достоинств, среди которых простота синтеза, исключительная химическая стабильность и фотостабильность, биосовместимость с эукариотическими клетками, возможность настройки длины волны эмиссии флуоресценции в широком спектральном диапазоне и широкий Стоксов сдвиг. Предполагается использовать два подхода к созданию подобной сенсорной системы. Первый подход заключается в применении химически синтезированных золотых нанокластеров для селективного окрашивания моновидовых и мультивидовых биопленок. Второй подход подразумевает селективный биосинтез золотых нанокластеров бактериями на клеточных стенках in situ, в результате которого грамположительные и грамотрицательные штаммы в составе биопленок сами становятся флуоресцентными метками разного цвета и интенсивности. Разработанный по итогам выполнения проекта сенсор будет отличаться простотой, оперативностью, высокой чувствительностью и селективностью. В представленном проекте впервые будут использованы биопленки для специфического мечения флуоресцентными золотыми нанокластерами. В частности, будут получены гибридные двувидовые биопленки почвенных (A. baldaniorum Sp245 и B. velezensis HR13) и условно-патогенных (S. aureus 209P и P. aeruginosa V-31) бактерий в качестве модельных систем для изучения пространственной организации микробного сообщества. Стоит отметить, что вышеназванная гибридная биопленка на основе почвенных бактерий отличается оригинальностью и ранее не описана в литературе. Впервые в работе будут применены золотые нанокластеры, флуоресцирующие в зеленом спектральном диапазоне, для детекции бактериальных клеток в составе биопленок. Полученная по итогам выполнения проекта сенсорная платформа будет иметь не только важное фундаментальное значение для выяснения основ биопленкообразования у разных типов бактерий, но и сможет внести вклад в создание полноценной диагностической системы для распознавания грамположительных и грамотрицательных штаммов в клинической практике.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Тумский Р., Хлебцов Б., Тумская А., Евстигнеева С., Антошкина Е., Захаревич А., Хлебцов Н.Г. Enhanced antibacterial activity of novel fluorescent glutathione-capped Ag nanoclusters International Journal of Molecular Sciences, V. 24 (9), P. 8306 (1-16) (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24098306

2. – Чистое с золотом: «нанофонарики» найдут микробы на медицинских инструментах Известия, №143 (31326), С. 5 (год публикации - 2023)

3. – В России создали золотые наночастицы для обнаружения и уничтожения патогенных бактерий ТАСС Наука, – (год публикации - 2023)

4. Чумаков Д.С., Евстигнеева С.С., Хлебцов Н.Г. Detection and imaging of bacterial biofilms using fluorescent nanosensor THE XXVII SARATOV FALL MEETING 2023, – (год публикации - 2023)

5. Евстигнеева С.С., Чумаков Д.С., Тумский Р.С., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г. Detection and imaging of bacterial biofilms with glutathione-stabilized gold nanoclusters Talanta, V. 264, P. 124773 (1-13) (год публикации - 2023)
10.1016/j.talanta.2023.124773

6. Черняк К.Н., Евстигнеева С.С. Оценка ферментативных тест-систем для определения устойчивости моновидовых и двувидовых биопленок к антимикробным агентам Сборник материалов ХII Всероссийской недели науки с международным участием Week of Russian science (WeRuS-2023), посвященной Году педагога и наставника. Саратов: Издательство Саратовского государственного медицинского университета имени В.И. Разумовского, С. 243-244 (год публикации - 2023)

7. – Золотые «фонарики» подсветят бактерии на медицинских устройствах Пресс-релизы РНФ, – (год публикации - 2023)

8. – Предложена «светящаяся» золотая краска для обнаружения бактериальных биопленок CoLab.ws, – (год публикации - 2023)

9. – «Нанофонарики» найдут микробы на медицинских инструментах Известия, – (год публикации - 2023)

10. Иголкина В.В., Евстигнеева С.С., Чумаков Д.С. Флуоресцирующие наноматериалы как перспективные агенты для детекции бактериальных биопленок Сборник материалов ХII Всероссийской недели науки с международным участием Week of Russian science (WeRuS-2023), посвященной Году педагога и наставника. Саратов: Издательство Саратовского государственного медицинского университета имени В.И. Разумовского, С. 231-232 (год публикации - 2023)

11. Чумаков Д.С., Евстигнеева С.С., Хлебцов Н.Г. Preparation of fluorescently labeled bacteria via biogenic synthesis of orange-red emitting gold nanoclusters Journal of Biomedical Photonics & Engineering, Vol. 10, No. 4, pp. 040309-(1-9) (год публикации - 2024)
10.18287/JBPE24.10.040309

12. Евстигнеева С.С., Чумаков Д.С., Черняк К.Н., Иголкина В.В. Detection of the lipopolysaccharide endotoxin using fluorescent gold nanoclusters The 4th International Electronic Conference on Biosensors. Program and Abstract Book. , P. 80 (год публикации - 2024)

13. Чумаков Д.С., Евстигнеева С.С., Иголкина В.В., Хлебцов Б.Н. Biofunctionalization of CTAC-stabilized gold petal-like gap-enhanced Raman tags with monoclonal antibodies via a polydopamine coating for the detection of the SARS-CoV-2 spike protein The 4th International Electronic Conference on Biosensors. Program and Abstract Book. , P. 75 (год публикации - 2024)

14. Евстигнеева С.С., Чумаков Д.С. Разработка моделей и подходов для флуоресцентной визуализации бактериальных биопленок на медицинских материалах на основе нанокрасителей 6-я Российская конференция по медицинской химии. Сборник тезисов., С. 74 (год публикации - 2024)

15. Евстигнеева С.С., Чумаков Д.С., Гулий О.И. Бактериальные биопленки и современные методы их обнаружения на различных субстратах PLAMIC2024. Материалы IV Международной научной конференции «Растения и микроорганизмы: биотехнология будущего» и III Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы адаптации микроорганизмов к различным условиям среды обитания»., С. 412-414 (год публикации - 2024)

16. Чумаков Д.С., Евстигнеева С.С., Гулий О.И. Luminescent nanozyme-based sensors for bacteria detection Applied Biochemistry and Microbiology, Vol. 60, No. 6, pp. 1022–1034 (год публикации - 2024)
10.1134/S0003683824606139

17. Чумаков Д.С., Евстигнеева С.С., Хлебцов Н.Г. Gold nanoclusters-based fluorescence assay for detection of lipopolysaccharide endotoxins THE XXVIII SARATOV FALL MEETING 2024, – (год публикации - 2024)

18. Гулий О.И., Евстигнеева С.С., Чумаков Д.С. Nanosensor systems for viral infectious diseases diagnosis Azad U.P., Chandra P. (eds.), Handbook of Material Engineering in Nanobiomedicine and Diagnostics. Springer Nature Singapore Pte Ltd., Chapter 24. P. 1-27 (год публикации - 2025)
10.1007/978-981-97-7445-6_24

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Впервые получены двувидовые биопленки, состоящие из грамположительных и грамотрицательных штаммов, на основе почвенных бактерий Azospirillum baldaniorum Sp245 и Bacillus velezensis HR13 и на основе условно-патогенных бактерий Staphylococcus aureus 209Р и Pseudomonas aeruginosa V-31. Отмечены различия в степени заселения бактериями гидрофильных и гидрофобных поверхностей с образованием двувидовых биопленок. Была выполнена количественная оценка биомассы и толщины гибридных биопленок бактерий A. baldaniorum Sp245 / B. velezensis HR13 и P. aeruginosa V-31 / S. aureus 209P. С применением сканирующей электронной микроскопии была охарактеризована трехмерная организация данных двувидовых биопленок. Продемонстрирована способность химически синтезированных золотых нанокластеров (ch-OE-GSH-AuNCs) универсально окрашивать биопленки A. baldaniorum Sp245 / B. velezensis HR13 и P. aeruginosa V-31 / S. aureus 209P. Флуоресцентная микроскопия показала, что ch-OE-GSH-AuNCs окрашивают двувидовые биопленочные сообщества с такой же интенсивностью, как и соответствующие им моновидовые формы. С помощью молекулярного моделирования оценивали взаимодействие нанокластеров ch-OE-GSH-AuNCs с различными мишенями в составе внеклеточного полимерного матрикса биопленок грамположительных и грамотрицательных бактерий, а именно белковой (амилоидные белки TapA и TasA, основной белок наружной мембраны бактерий OmaA) и углеводной (липополисахариды (ЛПС)) природы. По данным докинга ch-OE-GSH-AuNCs имели наибольшее сродство к амилоидным белкам матрикса TapA и TasA, при этом не связываясь с мембранным белком OmaA. В то же время, ch-OE-GSH-AuNCs прикреплялись к молекулам ЛПС посредством прочных водородных связей и обширных ван-дер-ваальсовых взаимодействий с полисахаридными цепями. Была оптимизирована технология биосинтеза GSH-AuNCs (bio-GSH-AuNCs) планктонными культурами A. baldaniorum Sp245, P. aeruginosa V-31, B. velezensis HR13 и S. aureus 209P в условиях in situ и выполнена характеристика их спектральных свойств. Максимумы эмиссии bio-GSH-AuNCs сдвигались в красную спектральную область по сравнению с ch-OE-GSH-AuNCs. Так, для bio-GSH-AuNCs, полученных бактериями A. baldaniorum Sp245, пик эмиссии локализовался при λem = 638 нм. Максимум эмиссии bio-GSH-AuNCs, полученных бактериями S. aureus 209Р, составлял λem = 662 нм. Стоит отметить, что спектры эмиссии флуоресценции bio-GSH-AuNCs содержат два пика: первый пик в красной спектральной области соответствует эмиссии нанокластеров, второй пик в синей области – автофлуоресценции бактериальных клеток. Для биосинтезированных нанокластеров максимум возбуждения флуоресценции располагается в ультрафиолетовой области (λex = 365 нм), что также отличает их от ch-OE-GSH-AuNCs, которые наиболее эффективно возбуждаются синим светом. Впервые в мире были получены биосинтетические bio-GSH-AuNCs с помощью одновидовых (A. baldaniorum Sp245, P. aeruginosa V-31, B. velezensis HR13, S. aureus 209Р) и двувидовых (A. baldaniorum Sp245 / B. velezensis HR13 и P. aeruginosa V-31 / S. aureus 209P) биопленок в условиях in situ. Данные нанокластеры позволяли универсально визуализировать биопленки грамположительных и грамотрицательных штаммов, а также их смешанные микробные сообщества. Полученные биогенные bio-GSH-AuNCs флуоресцировали в оранжевом спектральном диапазоне. Разработана уникальная система мечения бактериальных клеток, как в планктонной, так и в биопленочной формах на основе биосинтетических bio-GSH-AuNCs. Бактериальные клетки, несущие такие нанокластеры, могут использоваться в качестве флуоресцентных зондов широкого спектра действия (для визуализации отдельных ризобактерий, либо моновидовых и мультивидовых биопленок на корневой системе растений с целью исследования симбиотических взаимодействий in situ, а также для выявления бактериальных инфекций, ассоциированных с образованием биопленок на поверхности медицинских устройств или органов и тканей).

Публикации

9. – «Нанофонарики» найдут микробы на медицинских инструментах Известия, – (год публикации - 2023)