Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Методом ПЦР в реальном времени исследована экспрессия ранее идентифицированных генов высоко-аффинных нитратных переносчиков - SaNRT2.1, SaNRT2.5 и SaNAR2.2 - в органах растений Suaeda altissima, растущих при высоких (15мМ) и низких (0,5 мМ) концентрациях нитрата в питательной среде, при различных уровнях засоления питательной среды (0, 250, 500, 750 мМ NaCl). Матрицы кДНК для анализа экспрессии SaNRT2.1, SaNRT2.5, SaNAR2.2 были синтезированы на матрицах препаратов суммарной РНК, выделенной из органов (корни, стебли, листья) растений сведы, растущих при указанных ионных условиях питательной среды. ПЦР-анализ проводили с использованием готовой реакционной смеси, содержащей интеркалирующий краситель SYBR Green I (Евроген, Москва). В качестве референсного гена использовали ген фактора элонгации 1 альфа из сведы (SaeEF1alpha, GenBank ID: MN076325.1). Найдено, что экспрессия генов SaNRT2.1, SaNRT2.5 и SaNAR2.2 является орган-специфичной и обнаруживается, преимущественно в корнях. Экспрессия этих генов существенно стимулируется при дефиците нитрата в питательной среде и при возрастающих концентрациях соли NaCl, что свидетельствует в пользу роли белков SaNRT2.1, SaNRT2.5 и SaNAR2.2 как высоко-аффинных переносчиков нитрата, участвующих в поглощении нитрата растениями Suaeda altissima при засолении и недостатке нитрата в питательной среде. Белки семейства NAR2 являются партнерами в двухкомпонентной высокоаффинной системе транспорта нитрата NRT2/NAR2. С применением метода бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) в листьях табака Nicotiana benthamiana продемонстрировано взаимодействие белков SaNRT2.1/SaNRT2.5 и SaNAR2.2. На основе векторов pSPYNE-35S и pSPYCE-35S созданы векторные конструкции для анализа взаимодействия белка SaNAR2.2 с белками SaNRT2.1 и SaNRT2.5. Плазмиды pSPYNE-35S и pSPYCE-35S содержат, соответственно, N-концевой фрагмент (155 аа) и С-концевой фрагмент (84 аа) флуоресцентного белка mVenus. Последовательность SaNAR2.2 была клонирована в вектор pSPYCE-35S перед последовательностью, кодирующей С-концевой фрагмент белка mVenus (получена конструкция pSPYCE-35S-SaNAR2.2). Последовательности SaNRT2.1 и SaNRT2.5 были клонированы (каждая в отдельности) в вектор pSPYNE-35S перед последовательностью, кодирующей N-концевой фрагмент mVenus (получены конструкции pSPYNE-35S-SaNRT2.1 и pSPYNE-35S-SaNRT2.5). Полученные конструкции использовали для трансформации Agrobacterium tumefaciens. Бактериальными трансформантами были инфильтрованы листья 40-дневных растений Nicotiana benthamiana. После инфильтрации растения инкубировали при 21 ℃ в течение 3-х дней для экспрессии трансгенов, после чего фрагменты листа исследовали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM-710-NLO (Carl Zeiss, Jena, Germany). Ко-экспрессия в листьях N. benthamiana SaNAR2.2, слитого с С-концевым фрагментом флуоресцентного белка mVenus, и SaNRT2.1 или SaNRT2.5, каждый из которых был слит с N-концевым фрагментом mVenus, приводила к восстановлению флуоресценции белка mVenus. Последнее показывает тесное физическое сближение двух фрагментов mVenus и свидетельствует, что между белками SaNAR2.2 и SaNRT2.1/SaNRT2.5 действительно осуществляется взаимодействие. Флуоресценцию mVenus можно было наблюдать на периферии трансформированных клеток табака, что соответствует расположению взаимодействующих белков NRT2/NAR2 в плазматической мембране. Была исследована предполагаемая нитрат-транспортирующая активность белков SaNRT2.1, SaNRT2.5 и двухкомпонентной транспортной системы SaNRT2.1/SaNAR2.2 или SaNRT2.5/SaNAR2.2 как поглощение нитрата клетками мутантного штамма Δynt1 метилотрофных дрожжей Hansenula (Ogataea) polymorpha, в котором отсутствует ген единственного нитратного переносчика YNT1 и который был трансформирован векторными конструкциями, несущими кодирующие последовательности SaNRT2.1/SaNRT2.5 и SaNAR2.2. Методом qRT-PCR был определен значимый уровень экспрессии трансгенов SaNRT2.1, SaNRT2.5 и SaNAR2.2 в клетках трансформантов мутантного штамма Δynt1. Результаты данных экспериментов показали, что ни один из вариантов трансформантов Δynt1 не отличался от нокаут-мутанта Δynt1 по способности к поглощению нитрата; значимое поглощение нитрата наблюдали только для дикого типа DL-1. Отсутствие поглощения нитрата клетками трансформантов мутанта Δynt1, с учетом наличия соответствующих транскриптов в дрожжевых клетках, может указывать на необходимость посттрансляционных модификаций исследуемых белков для проявления их транспортной активности. Также отсутствие поглощения нитрата клетками трансформантов мутанта Δynt1 может объясняться тем, что гетерологичные белки не достигают в дрожжевых клетках места своего предназначения – плазматической мембраны. С целью визуального контроля локализации гетерологично экспрессируемых белков SaNRT2.1/SaNRT2.5 и SaNAR2.2 в клетках трансформантов мутанта Δynt1 были созданы векторные конструкции pCHLX-SaNRT2.1-GFP, pCHLX-SaNRT2.5-GFP и pCCUR2-SaNAR2.2-mCherry, в которых кодирующие последовательности SaNRT2.1/SaNRT2.5 и SaNAR2.2 были слиты, соответственно, с кодирующими последовательностями зеленого флуоресцентного белка GFP и красного флуоресцентного белка mCherry. Соответствующие белковые продукты несли флуоресцирующую добавку на С-конце. Визуальная инспекция культуры трансформированных дрожжевых клеток с помощью лазерного сканирующего микроскопа показала, что рекомбинантные белки SaNRT2.1/SaNRT2.5 и SaNAR2.2 ко-экспрессируются в дрожжевых клетках, однако локализованы они, преимущественно, не на периферии, а в объеме дрожжевой клетки, скорее всего, в эндоплазматическом ретикулуме, т.е. не достигают в дрожжевых клетках места своего предназначения – плазматической мембраны. Этим может объясняться отсутствие поглощения нитрата клетками трансформантов дрожжевого мутанта Δynt1.