КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 23-24-00463
НазваниеИсследование структуры гетеродимерного комплекса сериновой протеазы вируса Денге методами магнитного резонанса
Руководитель Шернюков Андрей Владимирович, Кандидат химических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение науки Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова Сибирского отделения Российской академии наук , Новосибирская обл
Конкурс №78 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-202 - Протеомика; структура и функции белков
Ключевые слова вирус Денге, сериновая протеаза, неструктурные белки NS2B и NS3, ЭПР спектроскопия
Код ГРНТИ34.17.00
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Тяжелая лихорадка Денге является основной причиной серьезных заболеваний и смерти в странах Азии и Латинской Америки. В настоящее время около половины населения мира находится в группе риска. На текущий момент специфического лечения лихорадки Денге/тяжелой формы Денге не существует. Необходимость участия в размножении вируса Денге в клетке собственной протеазы делает ее привлекательной мишенью для предотвращения инфекции. Для эффективного катализа сериновой протеазе вируса Денге необходим белковый кофактор, образующий с ней гетеродимерный комплекс, при этом детали их взаимодействия на структурном уровне до конца не установлены. Кроме того, во всех структурных исследованиях используют урезанный гидрофильный домен неструктурного белка NS2B (кофактор), при этом остаются не ясными вопросы о том как вырезанные трансмембранных домены влияют на структуру и динамику гидрофильного домена NS2B в гетеродимерном протеазном комплексе NS2B-NS3pro. Решение этих проблем может привести не только к улучшению нашего понимания природы катализа сериновых протеаз флавивирусов, но и к созданию более лучших, в том числе аллостерических, ингибиторов протеазы, которые можно будет использовать в качестве эффективных лекарственных средств в лечение лихорадки Денге.
Цель проекта – решение актуальных задач в области изучения структуры и динамики сериновой протеазы вируса Денге методами импульсной ЭПР спектроскопии. Проект посвящен изучению сложных биологических систем методами магнитного резонанса. Для достижения цели проекта - исследования структуры и динамики сериновой протеазы вируса Денге, будет применены методы импульсной ЭПР спектроскопии, обладающий несколькими существенными преимуществами для изучения больших белковых молекул и их комплексов. Так, метод дипольного ЭПР позволяет измерить большие (по сравнению с ЯМР) расстояния внутри биомолекул (до 8 нм) и, в применении к протеазе Денге, позволит получить информацию об организации гетеродимерного протеазного комплекса.
Научная новизна планируемых исследований:
- Метод импульсной дипольной ЭПР спектроскопии будет впервые применен к исследованию гетеродимерного комплекса NS2B-NS3pro протеазы вируса Денге.
- Будет впервые исследован протеазный комплекс с полноразмерным белком NS2B в присутствии мембраномиметика. Это позволит сделать вывод о влиянии трансмембраных доменов и близости к мембране на строение гетеродимерного протеазного комплекса вируса Денге.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В рамках проекта было продолжено выполнение запланированной программы исследований, направленных на изучение структуры и функции гетеродимерной протеазы вируса Денге второго серотипа. Основная цель заключалась в создании набора нескольких вариантов белков NS2B и NS3pro, необходимых для последующего анализа методами электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Для метода ЭПР необходимо направленное введение парамагнитных спиновых меток (в качестве которых выступают стабильные нитроксильные или тритильные радикалы) в структуру белка. Для этих целей использовалось получение набора одноцистеиновых мутантов белков NS2B (замены на аминокислотные остатки цистеина в позициях A57C, S75C и S79 последовательности) и NS3pro (замены на аминокислотные остатки цистеина в позициях G14C, S34C, S68C, S158C и S171C). Для общей проверки методики и корректности фолдинга гетеродимерного комплекса методом ЯМР были оптимизированы методики наработки изотопно-обогащенных белков 15N-NS2B (дикий тип) и 15N-NS3pro (каталитически неактивный мутант S135A). Для создания тест-системы на основе исследуемого конструкта, были наработаны белки NS2B и NS3pro дикого типа. Тест-система позволит проводить тестирование ингибирующей активности протеазы вируса Денге второго серотипа различных перспективных соединениях, синтезируемых в НИОХ СОРАН или других институтах. Работа по наработке белков продолжалась в течение всего 2024 года.
В рамках проекта для создания гетеродимерного комплекса был разработан способ расщепление тромбинового сайта с использованием фермента тромбина, который выделяется из крови крупного рогатого скота и является компонентом медицинского набора для определения протромбинового времени в крови человека. Разработка подхода стала необходима вследствие недоступности специализированных наборов для расщепления тромбиновых сайтов и рекомбинантного тромбина иностранных производителей. В результате исследований был разработан метод получения белка NS2B без His-тега, который необходим для сборки несвязанного линкером конструкта гетеродимерной протеазы вируса Денге II.
Для успешного проведения молекулярного моделирования необходима параметризация новых спиновых меток, которые предполагается применять в исследовании. В связи с этим была выполнена параметризация новой рН-чувствительной спиновой метки, пригодной для изучения изменений электростатических взаимодействий в белках. Тестирование данной параметризации проводилось в процессе молекулярно-динамических симуляций комплекса белка FPG с ДНК, что позволило установить расположение спиновой метки относительно активного центра белка. В итоге результаты вошли в статью, направленной в авторитетный научный журнал.
Возможность практического использования результатов
Тест-система на основе конструкта используемого в проекте, может быть использована для разработки эффективных ингибиторов протеазы вируса Денге II.