Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Ортофлавивирусы, к которым относится и вирус клещевого энцефалита (ВКЭ), являются актуальной угрозой в области здравоохранения. Инфекция вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ) может привести к тяжелым неврологическим осложнениям, в значительной степени связанным с активацией врожденного иммунитета и воспалительных реакций в тканях нервной системы. Несмотря на активное изучение, до сих пор детальные детерминанты и механизмы патогенеза ВКЭ полностью не раскрыты. В последнее время пристальное внимание ученых привлекли внеклеточные везикулы, которые, как оказалось, играют важную роль в патогенезе многих вирусов. В данной работе было исследовано влияние неструктурного белка 1 (NS1) вируса клещеного энцефалита на выделение внеклеточных везикул клетками, а также оценена возможность влияния этих везикул на другие клетки. В результате выполнения работ в 2024 году получены данные о влиянии экспрессии неструктурного белка 1 изолятов Сибирского и Дальневосточного субтипов вируса клещевого энцефалита на продукцию клетками внеклеточных везикул и их воздействии на другие клетки. Подобран протокол выделения внеклеточных везикул, позволяющий отделить везикулы от свободного секретированного белка NS1, а также расширены параметры характеристики везикул. Оценена способность внеклеточных везикул из NS1-экспрессирующих клеток влиять на активацию генов провоспалительных цитокинов, а также каскада интерферонового ответа I типа. Для исследования фракций внеклеточных везикул разного размера, содержащих апоптотические тельца, эктосомы и экзосомы, проведена оптимизация протоколов их выделения из среды культивирования клеток, экспрессирующих NS1. Выделенные популяции внеклеточных везикул охарактеризованы по тотальному содержанию белка, по размерам и по наличию маркерных белков и примесей, нехарактерных для везикул. Показано, что для функционального исследования наиболее пригодно культивирование в среде с 10% сывороткой с удаленными внеклеточными везикулами, а культивирование в бессывороточной среде снижает секрецию внеклеточных везикул малого размера. Протестированы условия дифференциального центрифугирования (длительность, скорость, количество стадий). Для исследования функциональных свойств везикул малого размера оптимальным был выбран протокол с отделением фракции апоптотических телец, концентрировании и последующей гель-фильтрацией на Sepharose CL-2B, отделяющей свободные белки от фракции внеклеточных везикул. Полученные по оптимальному протоколу препараты содержат преимущественно малые внеклеточные везикулы размером 50-200 нм с примесью более крупных везикул размером 200-500 нм. Анализ маркеров иммуноблотингом выявил присутствие специфических белков экзосом с небольшой долей белков эктосом и отсутствие нехарактерных для везикул примесей. Для характеристики размеров и концентрации выделенных внеклеточных везикул использованы динамическое светорассеяние на приборе ZetaSizer Ultra, анализ траекторий наночастиц приборе NS300, которые были дополнены просвечивающей электронной микроскопией. На первом году выполнения проекта было обнаружено присутствие NS1 во фракциях внеклеточных везикул различного размера. Во второй год выполнения проекта был проведен подбор условий выделения и характеристики фракций и расширена панель антител, для определения маркеров популяций иммуноблотингом. Модификация протоколов выделения показала уменьшение содержания NS1 при введении дополнительных промывок, отделении свободных белков гель-хроматографией или при обработке протеиназой К. Это указывает на то, что NS1 ВКЭ находится снаружи внеклеточных везикул и, по-видимому, не встроен в мембрану, а только ассоциирован с ней. Связывание NS1 c везикулами может происходить уже после независимой секреции везикул и NS1. Проведено сравнение влияния экспрессии в клетках НЕК293Т NS1 Сибирского (изолят Васильченко) и Дальневосточного (изолят Софьин) субтипов вируса на параметры выделяемых внеклеточных везикул. Все фракции внеклеточных везикул, полученных как по протоколу с осаждением с коммерческим реактивом, так и гель-фильтрацией, не различались по тотальному содержанию белка, размерам и количеству частиц, а также наличию NS1 и маркеров. Таким образом, экспрессия NS1 Сибирского и Дальневосточного субтипов одинаково влияет на количество, размер и присутствие основных маркеров внеклеточных везикул. Проведены исследования функциональности полученных внеклеточных везикул, выраженной в способности стимулировать воспалительные реакции в клеточных линиях нейробластомы и глиобластомы. По сравнению с везикулами, полученными из среды культивирования клеток, трансфицированных пустым вектором, везикулы, полученные из среды культивирования клеток, экспрессирующих NS1 изолята Софьин клеток НЕК293Т, способны вызывать повышение содержания мРНК и секреции только интерлейкина-1 бета (IL-1b), но не интерлейкина-6 (IL-6) и фактора некроза опухолей-альфа (TNF-α), в клетках нейробластомы, и не оказывают влияния на клетки глиобластомы. Везикулы, полученные из среды культивирования клеток, экспрессирующих NS1 изолята Васильченко, не оказывали влияния на содержание мРНК и секрецию провоспалительных цитокинов в клетках обеих линий. Обработка внеклеточными везикулами из NS1 изолята Софьин -экспрессирующих клеток с последующей стимуляцией poly(I:C) приводила в клетках нейробластомы к более высокому уровню мРНК IL-6, TNF-α и интерферона-бета. При этом везикулы из клеток, экспрессирующих NS1 изолята Васильченко, подавляли активацию IL-6 в клетках нейробластомы при стимуляции poly(I:C), но также как везикулы из NS1 изолята Софьин-экспрессирующих клеток, способствовали повышенной активации интерферона-бета. В клетках глиобластомы обработка внеклеточными везикулами из клеток, экспрессирующих NS1 обоих изолятов, и последующая стимуляция poly(I:C) не оказывала влияния на содержание мРНК всех исследуемых генов. Таким образом, результаты данного исследования указывают на важную роль NS1 в нейропатогенезе вируса клещевого энцефалита и необходимость его дальнейшего изучения. Полученные в ходе выполнения данные были представлены на 27-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых с международным участием «Биология – наука XXI века» (https://elibrary.ru/item.asp?id=67923725), и по результатам исследования подготовлены две статьи Стародубовой и др. «Экспрессия неструктурного белка 1 вируса клещевого энцефалита стимулирует секрецию внеклеточных везикул, способных активировать выработку IL-1B» и Кузьменко и др. «Неструктурный белок 1 вируса клещевого энцефалита и внеклеточные везикулы из экспрессирующих его клеток влияют на активацию транскрипции генов врожденного иммунного ответа в клетках нейро- и глиобластомы», которые приняты к публикации в журнале «Молекулярная биология».