Аннотация результатов, полученных в 2024 году
1. Для проведения работ второго этапа были подготовлены новые образцы гиппокампа мышей линии C57Bl/6 в возрасте 8 недель. Подготовка гиппокампа проводилась по стандартной процедуре. Образцы готовили для исследований методом оптическо-зондовой нанотомографии, реализуемой на уникальной научной установке «Система Зондово-Оптической 3D Корреляционной Микроскопии», http://ckp-rf.ru/usu/486825/ (далее – УНУ). Подготовка проводилась путем инфильтрации ткани акрилатной заливочной средой. После полимеризации заливочной среды твердые блоки с фрагментом гиппокампа готовы к дальнейшему исследованию. Часть срезов перед процедурой инфильтрации были окрашены на астроцитарные белки цитоскелета – глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP). Процедура окрашивания проводилась по стандартной методике иммуноцитохимического окрашивания. 2. В связи с тем, что плотность полимеризованного блока с образцом является одним из главных факторов получения качественных изображений СЗМ, мы провели вариацию процентного соотношения компонент заливочной среды для определения оптимальной плотности. Было определено, что использование смеси с 15% массовой долей сшивателя является оптимальным, так как при 5%масс. блок становится недостаточно твердым для хорошего фазового контраста и при резке алмазным ножом образуются «затяжки». 3. На втором этапе проекта применение просвечивающей электронной микроскопии было решено минимизировать, а в дальнейшем отказаться полностью. В связи с тем, что это усложняет процесс получения/накопления данных и делает невозможным измерения, совмещенные с флуоресцентной микроскопией, т.к. при контрастировании солями тяжелых металлов происходит деградация флуорофоров. А в нашем случае флуоресцентные метки являются наиболее простыми и очевидными «мишенями» для определения положения фрагментов астроцитов. Кроме того, очевидна сложность детализации и идентификации структурных элементов тканей на изображениях, полученных методами сканирующей зондовой микроскопии. Также, трудностью применения методики оптическо-зондовой нанотомографии (ОЗНТ), реализуемой на УНУ, для реконструкции биологических объектов остается отсутствие как таковой автоматизации процесса построения 3D реконструкций исследуемых образцов. Для решения указанных проблем мы пошли путем интеграции и адаптации дополнительного программного обеспечения, способствующего построению трехмерных реконструкций из данных СЗМ, и дальнейшей перспективой усовершенствования и расширения функциональности программы с помощью машинного обучения, пользовательских модулей и скриптов на Python. В первую очередь была разработана методика выравнивания слоев в серии изображений (СЗМ и ОМ) по реперной точке. Разработанный способ позволяет получить наибольшие по размерам выравненные слои, в которых реперная точка будет иметь одинаковую координату, а слои сохранять одинаковый размер. Это необходимо, так как одинаковый размер слоев в серии – обязательное требование для загрузки файлов в приложение для построения 3D модели в программе 3D Slicer [https://doi.org/10.1016/j.mri.2012.05.001, https://www.slicer.org/]. Следующим шагом была произведена адаптация свободного программного обеспечения 3D Slicer для методики ОЗНТ. Подготовленные изображения загружали и обрабатывали в 3D Slicer. 3D Slicer — это открытая, свободно распространяемая программная платформа для анализа, визуализации и обработки медицинских изображений, а также для выполнения задач трехмерной реконструкции. Благодаря модульной архитектуре возможно расширять функциональность программы с помощью пользовательских модулей и скриптов на Python. Программа поддерживает интеграцию с машинным обучением, обработкой больших данных и 3D-печатью, что делает её универсальным инструментом для задач в области медицинской визуализации и биоинженерии. Благодаря этим возможностям и расширениям программы мы адаптировали применений 3D Slicer для ОЗНТ. Была выработана последовательность шагов для использования 3D Slicer с изображениями СЗМ/ОМ, полученных ОЗНТ, включающая: конвертацию данных СЗМ в совместимый формат, импорт данных в 3D Slicer, фильтрацию и нормализацию, визуализацию данных, анализ данных (сегментацию), создание пользовательских модулей, экспорт данных. 4. Накопление массива изображений СЗМ При разработке сегментационной нейронной сети для распознавания пространственно распределенных астроцитов критически важным этапом является создание репрезентативных тестовой и валидационной выборок. Правильное формирование этих выборок обеспечивает объективную оценку производительности модели и ее способность к обобщению на новых данных. Исходный набор данных (датасет) в нашем случае сформирован из СЗМ изображений образцов гиппокампа. Изображения содержат разнообразные компоненты ткани гиппокампа, морфологические астроцитарные структуры, микроструктуры, дефекты поверхности, а также различный уровень фона и плотности клеток. Мы продемонстрировали ряд избранных полученных изображений СЗМ. Далее накопленные данные могут быть разделы на обучающую, валидационную и тестовую выборки в соотношении 70:15:15 или 25:5:5 (для первичной обработки), соответственно. При разделении должны учитываться следующие факторы: стратифицированное разделение; образцово-ориентированное разделение. 5. Построение трехмерной реконструкции. Проведено сегментирование и построение трехмерных реконструкций в 3D Slicer, после адаптации изображений СЗМ. С помощью модуля Segment Editor в режиме полуавтоматической сегментации на серии изображений СЗМ выделили интересующие структурные элементы в своих границах, создав, рабочую маску. Далее, выполнены выравнивания по реперной точке, сопоставлены флуоресцентные области с изображениями СЗМ. Таким образом точно определялась область, содержащая фрагмент астроцита. Данные последовательных изображений после сегментации преобразуются в трехмерное представление. После выполнения реконструкции возможно взаимодействовать с объемным изображением: вращение модели в трехмерном пространстве, изменение угла обзора, масштаба и уровня детализации, применение различных предустановок визуализации для выделения структур с разными уровнями плотности. Применив соответствующие алгоритмы, мы ограничили участок 3D модели, выделенный в области флуоресценции GFAB. В рамках ограниченного участка можно производить определение объема структуры, размеров тонких и толстых отростков, визуализировать взаимодействие с окружающими структурами. Описанный подход адаптации программной платформы 3D Slicer для ОЗНТ обеспечивает трехмерную визуализацию отдельных объектов в сложной структуре ткани. Таким образом, сформированная методика будет безусловно важна как в частных задачах, например, при реконструкции синаптического окружения, так и для широкого круга биомедицинских и материаловедческих направлений.