Исследование свойств новых антикоагулянтов из слюны медицинской пиявки Hirudo medicinalis

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-25-00006

НазваниеИсследование свойств новых антикоагулянтов из слюны медицинской пиявки Hirudo medicinalis

Руководитель Манувера Валентин Александрович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства" , г Москва

Конкурс №78 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые слова медицинская пиявка, Hirudo medicinalis, рекомбинантные белки, секрет слюнных желез, антистазины, кровь, система свертывания крови, гемостаз

Код ГРНТИ34.15.47

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Заболевания сердечно-сосудистой системы, связанные с повышенным тромбообразованием, представляют серьезную проблему, с которой сталкивается современная медицина. В настоящее время используется значительное число антикоагулянтов прямого действия природного происхождения. К их числу относятся гепарин, гирудин, стрептокиназа, урокиназа и другие. Однако, все они имеют определенные ограничения и поиск новых соединений, влияющих на гемостаз является достаточно актуальной задачей. Одним из источников природных антикоагулянтов служит секрет слюнных желез медицинских пиявок (ССЖ). Способность пиявок «разжижать кровь» известна с древности. Гирудин, один из компонентов слюны пиявок, уже длительное время используется в качестве компонента лекарственных средств. Кроме него, у пиявок обнаружен и ряд других веществ пептидной природы, предотвращающих образование тромбов. В их число входят дестабилаза-лизоцим, антистазины, эглины, бделластазин, гирудостазин, ингибиторы фактрора Xа, триптазы и другие. Широкий набор биологически активных веществ позволяет в ряде случаев использовать пиявок напрямую, позволяя им присасываться к пациенту. Однако у этого подхода есть целый ряд недостатков. В первую очередь, живые пиявки несут как на поверхности, так и внутри себя большое количество микроорганизмов, которые в процессе гирудотерапии могут инфицировать место укуса. Искусственное разведение пиявок не решает эту проблему полностью. Во-вторых, состав ССЖ изменяется в широких пределах и зависит от времени голодания, возраста пиявок, температуры окружающей среды и так далее. В связи с этим возникают трудности с подбором дозы и предсказанием терапевтического эффекта. Нельзя сбрасывать со счетов и эстетическую составляющую, для многих людей лечение с помощью кровососущих червей неприемлемо. Современные методы биотехнологии позволяют получать индивидуальные белки и пептиды из состава ССЖ с помощью гетерологичной экспрессии кодирующих их генов. В процессе выполнения предыдущего проекта (РНФ 17-75-20099) наш коллектив впервые расшифровал последовательность генома медицинской пиявки Hirudo medicinalis с использованием технологий секвенирования нового поколения. При анализе геномных и транскриптомных данных мы обнаружили ранее не описанные пептиды, предположительно являющиеся ингибиторами протеиназ. В их числе две новые изоформы гирудина, несколько предположительных форм антистазинов и бделлинов. Для изучения влияния этих пептидов на гемостаз необходимо было разработать способ их получения. В связи с тем, что они имеют значительный размер, простой химический синтез в данном случае неприменим. Мы использовали технологию рекомбинантных белков для получения этих пептидов в Escherichia coli и культуре клеток человека. Наработать и выделить в достаточных для анализа количествах удалось 15 полипептидов, представляющих 10 новых уникальных последовательностей потенциальных антикоагулянтов. В результате проведения стандартных гематологических тестов были выявлены три новых, ранее не описанных полипептида медицинской пиявки, обладающие ярко выраженной антикоагуляционной активностью в экспериментах in vitro. К сожалению, в связи с начавшейся пандемией Covid-19, нам не удалось подать заявку на продление проекта, так как все силы были были направлены на текущие задачи. В результате новые обнаруженные полипептиды с антикоагуляционными своствами остались неохарактеризованными. В случае одобрения подаваемой заявки мы планируем отработать методику выделеления обнаруженных антикоагулянтов до чистоты, соответствующей фармакологическим стандартам и провести детальное исследование их свойств in vitro и in vivo на крысиной модели тромбозов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Свидельская Г.С., Соркина В.П., Игнатова А.А., Пономаренко E.A., Полетаев А.В., Серегина Е.А., Манувера В.А., Жарков П.А., Миндукшев И. В., Гамбарян С., Пантелеев М.А. Assay variables and early clinical evaluation of low-angle light scattering for platelet function analysis International Journal of Hematology, International journal of hematology, 10.1007/s12185-024-03859-0. 22 Oct. 2024, doi:10.1007/s12185-024-03859-0 (год публикации - 2024)
10.1007/s12185-024-03859-0

2. Манувера В.А., Харлампиева Д.Д., Бобровский П.А., Графская Е.Н., Бровина К.А., Лазарев В.Н. New anticoagulant protein from medicinal leech Biochemical and Biophysical Research Communications, Biochemical and biophysical research communications vol. 696 (2024): 149473 (год публикации - 2024)
10.1016/j.bbrc.2024.149473

3. Манувера В.А., Бровина К.А., Бобровский П.А., Графская Е.Н., Харлампиева Д.Д., Лазарев В.Н. Method to assess the effects of bioactive compounds solutions on blood clotting Extreme Medicine, Extreme Medicine. 2024; (2): 113–7. DOI: 10.47183/mes.2024.026 (год публикации - 2024)
10.47183/mes.2024.026

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В ходе выполнения проекта в 2024 г разработана методика получения и очистки нового рекомбинантного цистеин-богатого белка-антикоагулянта медицинской пиявки (CRA) из культуры кишечной палочки. Определена гомогенность препаратов и содержание примесей ДНК, белков и липополисахаридов. Процесс получения рекомбинантного CRA включает в себя нарост биомассы E. coli, фракционирование бактериальных клеток, металл-хелатную хроматографию в денатурирующих условиях, рефолдинг методом быстрого разведения и очистку с помощью анионообменной хроматографии на DEAE-сефарозе. Для определения способности CRA ингибировать гемостаз проведена модификация методики выполнения трех стандартных клинических клоттинговых тестов - активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ) и тромбинового времени (ТВ). Целью было их применение при проведении измерений вносимых растворов антикоагулянтов, а не параметров сыворотки крови пациентов. С помощью модифицированных клоттинговых тестов проведен анализ влияния CRA на внешний (АЧТВ), внутренний (ПВ) и общий (ТВ) пути коагуляции. Показано, что во всех случаях рекомбинантный CRA проявляет свойства сильного антикоагулянта. Экспериментально показано, что CRA является сильным антикоагулянтом in vivo. Для этого было проведено два эксперимента на лабораторных мышах – на общую кровопотерю и тромбоз сонной артерии, индуцированный хлоридом железа. В эксперименте по определению общей кровопотери показано, что при введении внутрибрюшинно 100 мкг белка в течение часа хвостовое кровотечение не останавливается, а кровопотеря на порядок выше, чем у контрольной группы. При индуцировании тромбоза сонной артерии у мышей, которым ввели 100 мкг CRA внутривенно, формирования тромбов обнаружить не удалось, в отличие от контрольной группы. Получена укороченная версия CRA, лишенная С-концевого участка. Укороченный вариант накапливается в клетках E. coli в растворимом виде и проявляет антикоагуляционную активность в тестах in vitro. Он не требует выделения в денатурирующих условиях с последующим рефолдингом, в отличии от полноразмерной формы. Показано, что С-концевой участок CRA обуславливает его связывание с мембранными везикулами.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Результаты проведенных исследований показывают, что новый белок медицинской пиявки обладает польшим потенциалом в качестве антикоагулянта и значительно превосходит известный антикоагулянт гирудин. Он может быть использован при разработке новых лекарств, направленных на профилактику и лечение тромбозов.