Аннотация результатов, полученных в 2024 году
При выполнении проекта получены научные результаты, позволяющие использовать бактосомы, содержащие цитохром Р450 3А4 в качестве эффективных биореакторов. Для повышениея эффективности функционирования бактосом разработан подход с включением бактосом в нанопоры, образуемые порообразующим белком стрептолизином О на поверхности электрода, модифицированного мембраноподобным синтетическим соединением дидодецилдиметиламмония бромидом (ДДАБ). Разработана методика и оптимизированы параметры иммобилизации бактосом, содержащих цитохром P450 3A4, а также белки компоненты электрон транспортной цепи цитохром P450-зависимую редуктазу и цитохром b5 на электроде. Это позволило провести электрохимический анализ каталитической активности этого гемопротеина в условиях, наиболее полно отражающих функционирование фермента в организме. В качестве модификатора электродов применяли мембраноподобное соединение дидодецилдиметиламмония бромид (ДДАБ), используемое для иммобилизации биообъектов. Эффективность электрокатализа данной системы оценивали по накоплению продукта реакции N-деметилирования эритромицина – формальдегида по реакции Ханша и спектрофотометрической регистрацией при длине волны 412 нм. Эритромицин использован как маркерный субстрат цитохрома Р450 3А4, а также для сравнения эффективности электроферментативных реакций в разных системах. Каталитическую эффективность бактосом оценили по реакции цитохром Р450 3А4-ависимого гидроксилирования диклофенака в 5 положении с образование 5’-гидроксидиклофенака. Электроаналитические параметры бактосом, содержащих CYP3A4 (CYP3A4BR), иммобилизованных на ПГЭ/ДДАБ исследовали с помощью циклической вольтамперометрии в присутствии кислорода и 100 мкМ раствора субстрата (эритромицина или диклофенака) На ЦВА в присутствии кислорода регистрируется широкий пик в области потенциалов -0,432±0,014 В, соответствующий восстановлению гема СYP3A4, флавиновых кофакторов ФМН и ФАД в активном центре CPR, и гема цитохрома b5. В присутствии субстратов эритромицина или диклофенака наблюдается увеличение амплитуды каталитического тока, что является характеристической особенностью при взаимодействии цитохрома P450 с субстратом. Как следует из проведенных экспериментов, в присутствии 100 мкМ эритромицина и кислорода ПГЭ/ДДАБ/CYP3A4BR потенциал катализа равен Ecat = - 0,417 В, и является смещенным в положительную область потенциалов по сравнению с ПГЭ/ДДАБ/CYP3A4 Ecat = - 0,438 В, что свидетельствует о термодинамически более выгодном процессе. Проведен сравнительный анализ CYP3A4BR и CYP3A4 иммобилизованных на ПГЭ/ДДАБ Наибольшая аналитическая чувствительность равная 6,05×10-3 A M-1, наблюдается для ПГЭ/ДДАБ/CYP3A4 и эритромицина. Диклофенак проявляет слабые субстратные свойства к CYP3A4 человека. Согласно данным, представленным в литературе, константа Михаэлиса KM для диклофенака равна 78,9 ±10,2 мкМ, а для эритромицина 25±8 мкМ, это объясняет большую чувствительность по отношению к эритромицину, по сравнению с диклофенаком. Для CYP3A4BR получены меньшие значения аналитической чувствительности, это может объясняться затрудненной диффузией молекул субстрата через мембрану бактосом. Индекс связывания как отношение максимальной амплитуды тока в присутствии субстрата и без субстрата Icat/Ired для CYP3A4BR в случае диклофенака составляет 2,08±0,11, и 1,19±0,17 для эритромицина. Такое различие объясняется разницей в скорости диффузии лекарственных препаратов к активному центру CYP3A4 в бактосомах из-за различия в молярных массах субстратов. Молярная масса эритромицина составляет 733 гмоль-1 и значительно превышает молярную массу диклофенака 297 гмоль-1. Каталитическая активность CYP3A4BR превышает активность для CYP3A4, в реакции N-деметилирования эритромицина. Для анализа реакции 5-гидроксилирования диклофенака, была использована двухэлектродная схема регистрации каталитической активности. После протекания реакции CYP3A4-зависимого электрокаталитического 5’-гидроксилирования диклофенака, эффективность оценивали с помощью проведения реакции электроокисления диклофенака при положительных значениях потенциала. Показано, что в случае иммобилизации бактосом CYP3A4BR, эффективность электрокатализа выше, чем в случае иммобилизации рекомбинантного препарата CYP3A4. Полученное значение каталитической константы сравнимо с данными, представленными в литературе kcat 13,2 мин-1. С точки зрения создания биореактора, бактосомы проявили большую эффективность чем рекомбинантный фермент. Для повышения эффективности электроферментативных реакций бактосом был применен подход с использованием порообразующего белка стрептолизина О. В качестве наиболее эффективной для электрокаталитического применения формой были выбраны бактосомы содержащие цитохром Р450 3A4, применение которых позволило увеличить эффективность катализа с 0,28 мин-1 до 0,88 мин-1. Применение стрептолизина О показало себя как наиболее эффективный метод создания трехмерного окружения фермента. Поэтому был проведен анализ эффективности электрокаталитической системы, состоящей из бактосом, содержащих цитохром Р450 3A4 и модификатора на основе ДДАБ и стрептолизина О. Электроаналитические параметры бактосом, содержащих CYP3A4 (CYP3A4BR), иммобилизованных на ПГЭ/ДДАБ/SLO исследовали с помощью циклической вольтамперометрии в присутствии кислорода и 100 мкМ раствора субстрата эритромицина. ЦВА в присутствии кислорода регистрируется широкий пик в области потенциалов -0,462±0,004 В, соответствующий восстановлению гема СYP3A4, флавиновых кофакторов ФМН и ФАД в активном центре CPR, и гема цитохрома b5. В присутствии субстрата эритромицина наблюдается увеличение каталитического тока, что является характеристической особенностью при взаимодействии цитохрома P450 с субстратом. Значение индекса связывания как отношение максимальной амплитуды тока в присутствии субстрата и без субстрата для ПГЭ/ДДАБ/CYP3A4BR составило 3,82±0,39 в случае субстрата эритромицина, что значительно превышало значение этого параметра для электродов, модифицированных только ДДАБ, равное 1,19±0,17. Каталитическая константа в случае иммобилизации бактосом, содержащих CYP3A4 (CYP3A4BR), также возрастала с 0,88±0,18 мин-1 при иммобилизации на ДДАБ до 2,92 ± 0,23 мин-1 при иммобилизации на комбинации ДДАБ/SLO. Таким образом можно заключить, что оптимальным способом исследования каталитической активности цитохромов P450 является иммобилизация на поверхности рабочего электрода и работа в режиме тонкой пленки, использование бактосом как источника цитохрома Р450 и включение бактосом в нанопоры, образуемые порообразующим белком стрептолизином О. Полученные результаты опубликованы в статье (Electrochemical Assessment of CYP3A4 Catalytic Activity in Bactosomes. BioNanoScience (2024) 14:2930–2939. https://doi.org/10.1007/s12668-024-01539-1).