Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Zyxin это LIM-доменный белок, преимущественно локализованный в местах межклеточной адгезии, где формируются комплексы белков, участвующих в динамике цитоскелета и передаче сигналов. Кроме этого, Zyxin участвует в механотрансдукции, поскольку может перемещаться между ядром и местами клеточной адгезии, хотя основные механизмы и функция динамики его локализации неясны. Известно, что Zyxin млекопитающих является фосфопротеином. Так, фосфорилирование по серину 142 модулирует его активность, разрушая закрытую конформацию молекулы Zyxin по типу «голова-хвост». Кроме этого, показано, что Zyxin фосфорилируется киназой CDK1 во время митоза по позициям S281 и S344. Zyxin это эволюционно консервативный белок, демонстрирующий значительную консервативность своих основных доменов среди эукариотических организмов. Все гомологи Zyxin содержат три LIM домена на C-конце, которые необходимы для его локализации в местах фокальной адгезии, последовательность, необходимую для взаимодействия α-актинином и четыре пролин-богатых последовательности, которые опосредуют взаимодействие Zyxin с регуляторами актина Mena и VASP на N-конеце. В центральной части Zyxin млекопитающих содержит две богатые лейцином последовательности ядерного экспорта. Консерватизм этого белка дает возможность использовать модельный организм, эмбрионы шпорцевой лягушки Xenopus laevis для определения его роли в эмбриогенезе. Ранее было показано, что Zyxin является модулятором определенных сигнальных путей, важных для эмбриогенеза. Во-первых, Zyxin может напрямую связываться с транскрипционными эффекторами этих путей; например, с эффекторами пути Shh Gli1 и Zic1 , транскрипционным репрессором Xanf1/Hesx1 и фактором транскрипции Y-box Ybx1. Кроме этого, при изучении Zyxin из X. Laevis мы идентифицировали несколько его эндогенных изоформ c различной электрофоретической подвижностью. При помощи вестерн блоттинга с использованием антител, специфичных к N и С-концевым участкам Zyxin из X.laevis мы детектировали изоформы Zyxinа в условиях разделения в акриламидном геле с молекулярной массой 105 и 70 кДа . Но использование антител не дает возможности идентифицировать посттрансляционные модификации эндогенного белка и может окрашивать дополнительные полосы за счет неспецифического связывания. Для решения этой задачи мы дополнили изучение эндогенных форм Zyxin исследованиями с применением хромато-масс-спектрометрии. В результате применения метода хромато-масс спектрометрии с обогащением образцов методом коиммунопреципитации мы идентифицировали во-первых, N-концевое ацетилирование Zyxin по метионину 1; во-вторых два сайта фосфорилирования по серинам 197 и 386. Следует отметить, что в мировой литературе мало данных об ацетилировании Zyxin кроме статьи о его взаимодействии с NAD+-зависимой деацетилазой SIRT1. Показано, что SIRT1 модулирует функции различных ключевых белков- мишеней посредством деацетилирования и участвует в выживании клеток, дифференцировке, метаболизме и играет важную роль в нейродегенерации. Добавление ацетильной группы к аминокислотам в начале белка (известное как N- концевое ацетилирование, N-terminal acetylation, Nt-acetylation) имеет решающее значение для поддержания гомеостаза белка и функционирования клеток. Эта модификация происходит в более чем 50% белков в эукариотических организмах и при неправильной регуляции может привести к раку, гипертонии, нейродегенерации и т. д. N-концевое ацетилирование не только нацеливает белки на деградацию через определенный сигнальный путь, но также регулирует сворачивание белка, клеточную локализацию и активность. Эта необратимая модификация также может защищать белки от других механизмов деградации. Ингибирование взаимодействий белков, зависящих от N-концевого ацетилирования, может быть полезной стратегией для регулирования стабильности белка. Учитывая факт, что уровень экспрессии Zyxin оказывает влияние на такие важные процессы, как дифференцировка, апоптоз, миграция клеток, идентификация его N- концевого ацетилирования открывает дополнительные перспективы для изучения его активности. Возможно, ацетилирование играет важную роль в функционировании Zyxin и поэтому определение позиции присоединения ацетильной группы открывает новые возможности для изучения этого белка методом направленного мутагенеза на модели эмбрионов Xenopus laevis. Идентификация двух сайтов фосфорилирования по серинам 197 и 386 так же позволяет применить методы направленного мутагенеза для изучения локализации и функционирования этого механочувствительного белка-переносчика информации от цитоскелетных структур к ядерному аппарату транскрипции. Другим важным результатом проекта является изучение роли Zyxin в регенерации. По результатам первого этапа исследований методом вестерн-блоттинга было обнаружено, что в ядерной фракции возрастает одна из изоформ Zyxin на первый день после ампутации и приходит в исходное состояние уже на второй день после ампутации. С использованием накопленных ранее данных по экспрессии генов, участвующих в регенерации хвоста мы попытались узнать, какие гены могут регулироватся Zyxin. При сопоставлении данных широкомасштабного секвенирования транскриптома бластем на 0-1-2 день после ампутации (дпа) и транскриптомы клеток с нарушенной функцией Zyxin были отобраны наиболее интересные гены, которые могут регулироваться Zyxin. В результате показано, что гены семейства pou 5F3 (pou 5F3.1, pou 5F3.3), семейства lnx (lnx1, lnx3), bmp(5,7), agr2 являются наиболее вероятными мишенями Zyxin в ходе регенерации. Исходя из полученных данных можно предложить следующую гипотезу участия Zyxin в регенерации: на первом этапе формирования бластемы происходит гистолиз – клетки эпидермиса на краю разреза теряют свои межклеточные контакты, и мигрируют закрывая рану в течение нескольких часов. Далее клетки бластемы дедифференцируются и восстанавливают программу экспрессии эмбриональных генов, о чем свидетельствует нарастание транскриптов генов pou 5F3, известных маркеров стволового статуса клеток и резкое падение генов, участвующих в клеточной дифференцировке- lnx (lnx1, lnx3), bmp (bmp 5, bmp7). И уже потом восстанавливается тканеспецифичный паттерн регуляторов для восстановления всех структур. Все эти гены консервативны и имеют хорошо изученных гомологов у млекопитающих (так, факторы Pou 5F3 гомологичны фактору OCT4, известному как фактор коктейля Яманаки, маркера плюрипотентности), поэтому являются переспективными для тканевой инженерии в биомедицине.