Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В течение второго года работы по проекту для увеличения чувствительности опухолевых клеток различного происхождения к апоптотической гибели были применены три экспериментальных подхода - фармакологическое ингибирование аутофагии, индукция стресса ЭПР и его адаптивного ответа UPR (unfolded protein response) и подавление трансляции белков-сенсоров стресса ЭПР методом РНК-интерференции (сайленсинга генов). В работе использовали клетки карциномы шейки матки человека HeLa-R, обладающие повышенной резистентностью к химиотерапевтическим препаратам и ионизирующему излучению, клетки Т-лимфобластной лейкемии MOLT-3, полученные из периферической крови человека, и нейробластомы человека IMR-32, представляющие собой смесь нейробласт-подобных клеток и фибробластов. Для решения поставленных задач был применён комплексный методический подход с применением ПЦР в реальном времени, иммуноблоттинга, проточной цитометрии, флуоресцентной микроскопии. Для ингибирования аутофагии применяли хлорохин, который эффективно подавляет слияние аутофагосом и лизосом, препятствуя деградации белка. Для индукции стресса ЭПР использовали тапсигаргин, ингибитор Са2+-АТРазы мембран эндоплазматического ретикулума (SERCA), индуцирующий выход Са2+ из ЭПР в цитоплазму. Экспрессию генов и белков сравнивали в полных ростовых средах и в условиях сывороточного голодания. Для РНК-интерференции использовали siRNA к сенсорам стресса ЭПР PERK и IRE1. На уровне транскрипции и трансляции в клетках всех трёх типов была подтверждена взаимосвязь между индукцией стресса ЭПР или ингибированием аутофагии и увеличением экспрессии ключевых эффекторов апоптоза (каспаз 9, 12 и 3, анти-апоптотического белка Bcl-2, про-апоптотического белка Bax, транскрипционного фактора CHOP). Чувствительность клеток MOLT-3, IMR-32 и HeLa-R к хлорохину различалась, но активация генов апоптоза была выше в бессывороточной среде. При некоторых вариантах обработки клеток в них наряду с эффекторами апоптоза стимулировались и анти-апоптотические белки. Инкубация клеток всех трёх линий с тапсигаргином привела к более сильному и стабильному увеличению уровней мРНК и белка сигнальных молекул апоптоза. Таким образом, тапсигаргин является более сильным индуктором апоптоза, чем хлорохин. Оценка экспрессии ключевых эффекторов аутофагии (ULK-1, Beclin1, LC3/LC3-II, PI3K, Akt и mTOR) в клетках после обработки хлорохином показала, что блокирование аутофагии приводит к накоплению зрелых аутофагосом. Уровень модуляторов аутофагии PI3K, Akt и mTOR снижался в клетках MOLT-3, но не в IMR-32 и HeLa-R, что, вероятно, также связано с активацией защитных механизмов выживания. Обработка клеток всех трёх линий тапсигаргином привела к ингибированию экспрессии генов и белков ULK-1 и Beclin-1, но не оказала влияния на уровень LC3B, вероятно, вследствие блокирования начальных этапов аутофагии. Применение метода РНК-интерференции (трансфекции siRNA) также подтвердило взаимосвязь между ингибированием активности генов сенсоров стресса ЭПР – белков PERK и IRE1 и изменениями экспрессии сигнальных белков аутофагии (ULK-1, Beclin1, LC3В) и апоптоза (каспаз 9, 12 и 3, Bcl-2, Bax, CHOP). Показано, что эффективность siRNA для индукции апоптоза в клетках разных типов различается. Так, экспрессия белка PERK в клетках MOLT-3 и IMR-32 снижалась более чем на 50 %. Такая же картина наблюдалась и после применения siRNAs, специфичных для IRE1 (гена ERN1). Однако в клетках HeLa-R снижение уровней белков PERK и IRE1 после применения соответствующих siRNAs снижалось в среднем только на 20-30 % и не достигло статистической значимости, что указывает на большую устойчивость этих клеток к нарушению синтеза белка. Анализ экспрессии генов и белков аутофагии показал, что ответы клеток разного типа на подавление трансляции генов-сенсоров стресса ЭПР сильно различаются. Так, в клетках MOLT-3 применение siRNAs, специфичных для сенсоров стресса ЭПР PERK и IRE1, привело к снижению экспрессии маркера инициации аутофагии белка ULK-1 и его гена ULK1, а также белка фагофора Beclin-1 и его гена BЕCN1. Однако сайленсинг PERK и IRE1 не оказал влияния на экспрессию белка зрелых аутофагосом LC3B и его гена MAPLC3B. В клетках HeLa-R и IMR-32 наблюдалось снижение экспрессии гена и белка ULK-1, но увеличение уровней белков Beclin-1 и LC3B, хотя повышения соответствующих генов BЕCN1 и MAPLC3B не происходило. Это свидетельствует о том, что в клетках HeLa-R и IMR-32 после трансфекции активируются процессы аутофагии. Подавление трансляции белка IRE1 в клетках MOLT-3 и IMR-32 привело к повышению экспрессии генов и белков всех протестированных эффекторов апоптоза – каспаз-3 и 9, Bax и CHOP, но снижению уровня мРНК и белка про-апоптотического белка Bcl-2. Однако в клетках HeLa-R наряду с увеличением экспрессии гена и белка Bax наблюдалась и активация белков Bcl-2 и CHOP, а экспрессия каспазы-3 оставалась относительно стабильной, т.е. активировались не только начальные этапы апоптоза, но и аутофагия. Сайленсинг гена PERK в клетках MOLT-3 и IMR-32 также привёл к увеличению уровней мРНК и белка каспаз-3 и 9, Bax, но не оказал влияния на экспрессию Bcl-2 и CHOP. Таким образом, подавление активности IRE1 в клетках всех трёх линий является более эффективным способом индуцировать апоптоз. Результаты нашей работы показывают, что блокирование синтеза PERK и IRE1 снижает их функциональную активность как сенсоров нарушения баланса между накоплением дефектных резидентных и транзитных белков в ЭПР и его способностью справляться с такой избыточной нагрузкой. Это приводит к накоплению повреждённых белков в клетках, однако из-за недостаточной активности белков PERK и IRE1 они не способны уменьшить негативный эффект с помощью адаптивной стратегии UPR, и такие сильные стрессовые условия в конечном итоге увеличивают стресс ЭПР и сдвигают сигнальные пути UPR в сторону апоптоза.