Аннотация результатов, полученных в 2024 году
1. В 2024 году были проведены физиологические, поведенческие и фенотипические тесты на мышах дикого типа C57Bl/6, трансгенных линиях HSP70 (in), HSP70 (out), Fus[1-359], APP/PSEN1, а также двойных трансгенных линиях Fus[1-359]/HSP70 (in), Fus[1-359]/HSP70(out), APP/PSEN1/HSP70 (in) и APP/PSEN1/HSP70(out). Сравнение шести групп животных проводилось на возрастных точках 3 и 6 месяцев. Использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) и критерий Краскела-Уоллиса. Проведённые тесты («Открытое поле», «Лабиринт Барнса», «Распознавание образов», «О-образный лабиринт», «Резидент-интрудер», «Перевёрнутый экран», «Ротарод» и «Грип-тест») выявили нарушения когнитивных, двигательных и эмоциональных функций у животных с экспрессией FUS и APP/PSEN1, особенно при внеклеточной экспрессии HSP70. У двойных трансгенов с внутриклеточной экспрессией HSP70 эти нарушения менее выражены. Однако все группы с экспрессией FUS и APP/PSEN1 показывают значительные отличия от контроля. У животных с экспрессией FUS выявлены большие двигательные нарушения, а у животных с экспрессией APP/PSEN1 — когнитивные и поведенческие. Тест "Распознавание образов" показал особенности у FUS-экспрессирующих групп, возможно, связанные с лимбической системой. Результаты согласуются с данными морфологических исследований. 2. Гематологическое исследование показало отсутствие значимых различий между экспериментальными и контрольными группами, подтверждая нормальный иммунный статус животных. Повышение уровня нейтрофилов и эозинофилов было редким и равномерным среди всех групп. Эритроциты имели нормальное строение, основной процент пойкилоцитов составили шистоциты (40,5%) и акантоциты (25,7%), окраска дискоцитов была нормальной. Исследования на 3D-конфокальном профилометре и атомно-силовой микроскопии подтвердили физиологическое состояние эритроцитов. Это указывает на то, что наличие мутантных генов HSP70, FUS и APP/PS1 не влияет на морфологию эритроцитов. 3. Оценка выживаемости показала, что двойные трансгены с генами Fus[1-359] и HSP70 (in) живут дольше: до 30 недель против 20 у трансгенов с мутацией в гене Fus[1-359]. Для двойных трансгенов с генами Fus[1-359] и HSP70 (out) увеличение продолжительности жизни не наблюдалось. Выживаемость животных дикого типа соответствует норме. Исследование выживаемости животных с моделью Альцгеймера требует времени из-за их долгой жизни и позднего дебюта болезни. Характеристика выживаемости этих животных будет оцениваться позже. 4. Морфологическое исследование не выявило структурных изменений в лимфоидных органах (красный тимус, селезёнка, лимфатические узлы) между исследуемыми группами и контролем. У трансгенных по HSP70 животных обнаружено небольшое увеличение CD8+-клеток, что находится в пределах нормы. Иммуногистохимический анализ описан в пункте №6. 5. На первом месяце исследования гистологический анализ и молекулярный скрининг показали минимальные изменения, связанные с началом нейродегенерации. Белковый иммуноблоттинг подтвердил эффективность трансгенной аллели HSP70. Реакция против HSP70 у трансгенных животных была яркой, а у животных дикого типа – отрицательной или слабоположительной. Анализ иммунных цитокинов не дал значимой информации. 6. Изучались две модели двойных трансгенов: с FUS и APP/PS1. Влияние FUS исследовалось в моторной коре, спинном мозге и лимбической системе. В моторной коре у мышей с FUS уменьшилось количество NeuN+ клеток, особенно у двойных трансгенов. Число GFAP+ клеток осталось стабильным, за исключением группы с Hsp70 (out), где оно возросло. Число S100β+ клеток сильно увеличилось у всех групп с FUS, а Iba1+ клетки снизились только у Tg FUS. В спинном мозге у Tg FUS уменьшилось количество NeuN+ клеток и соотношение NeuN/DAPI. В лимбической системе у всех групп с FUS количество нейронов было снижено, особенно у Tg FUS/HSP70 (out). Для модели Альцгеймера в моторной коре у Tg APP и двойных трансгенов количество NeuN+ клеток снижалось, особенно у Tg APP/HSP70 (out). В зубчатой извилине число GFAP+ клеток увеличивалось у всех групп с APP, наиболее заметно у Tg APP/HSP70 (out). При исследовании маркеров воспаления и апоптоза получены слабые положительные реакции, которые не являются статистически значимыми. 7. Белковый иммуноблоттинг помог оценить эффекты, подтвержденные иммуногистохимическим анализом. Трансгенные животные с HSP70 показали выраженную реакцию на HSP70, что подтверждает успех трансгенной аллели. У животных дикого типа реакция была отрицательной или слабоположительной. Исследование иммунных цитокинов не дало значимых результатов. В нервной ткани животных с нейродегенерацией и двойных трансгенов наблюдаются гиперхромность клеток и накопление стрессовых гранул в цитоплазме нейронов при фусопатии. Такие явления зафиксированы в наших исследованиях. Другие цитопатологические эффекты, такие как пикнотичность, кариорексис, кариолизис и плазмокоагуляция, встречались редко и не считались критичными для оценки нейродегенерации. Мы разработали метод определения и анализа содержания белков теплового шока массой 70 кДа в срезах ткани головного мозга трансгенных мышей с использованием комбинационного рассеяния. Для фильтрации данных использовались пороговые значения интенсивности. Около 1.4% данных было исключено. Затем обучались модели классификации: логистическая регрессия, SVM, случайный лес и градиентный бустинг. Модели классифицируют спектры мозга в зависимости от содержания белка. Планируется дальнейшее совершенствование методов и обучение моделей для дифференциации спектров мозга мышей с гиперэкспрессией HSP70. Подана заявка на патент. 8. Результаты исследований были представлены на 2 научных конференциях. 9. Результаты опубликованы в 2 научных журналах, ещё 3 статьи приняты к публикации.