Молекулярно-генетические механизмы развития рестриктивной кардиомиопатии, ассоциированной с мутацией c.7416

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-25-00456

НазваниеМолекулярно-генетические механизмы развития рестриктивной кардиомиопатии, ассоциированной с мутацией c.7416_7418delGAA в гене FLNC

Руководитель Голиусова Дарья Владимировна,

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства" , г Москва

Конкурс №78 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые слова Рестриктивная кардиомиопатия, ген FLNC, филамин С, белковые агрегаты, аутофагия, протеостаз, протеотоксичность, шаперон BAG3, шаперон-опосредованная селективная аутофагия, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), дифференцировка, кардиомиоциты

Код ГРНТИ62.33.31

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Рестриктивная кардиомиопатия (РКМП) представляет собой одну из наиболее редких и слабо изученных форм кардиомиопатии с тяжелым течением и плохим прогнозом. В основе патогенеза лежит повышение жесткости и снижение пластичности миокарда, приводящее к развитию диастолической дисфункции вследствие рестриктивного типа кровенаполнения желудочков. Систолическая функция и толщина стенок сердца при этом не нарушаются. Большинство случаев первичной РКМП являются идиопатическими и вызваны генетическими причинами. Чаще всего мутации обнаруживаются в генах саркомерных и цитоскелетных белков. Среди выявленных 19 генов, ассоциированных с РКМП, особый интерес представляет ген филамина С (FLNC), экспрессирующийся преимущественно в скелетной и сердечной мускулатуре. Филамин С входит в состав Z-дисков и вставочных дисков саркомеров и, наряду со структурной функцией, играет важную роль в поддержании белкового гомеостаза клеток, в частности, в контроле аутофагии и системы деградации белков. На сегодняшний день описано два потенциальных механизма развития FLNC-ассоциированной кардиомиопатии: 1) гаплонедостаточность и потеря функции белка при наличии мутаций, вызывающих его укорочение, или чаще всего 2) неправильный фолдинг и агрегация белка при мутациях, не вызывающих укорочение белка. В рамках FLNC-ассоциированной РКМП в 93,8% случаев детектируются мутации, не вызывающие укорочения белка и приводящие к формированию агрегатов филамина С. Предполагается, что накопление таких агрегатов может перегружать систему аутофагии и убиквитин-протеасомную систему деградации. В норме сократительный аппарат клетки подвергается непрерывному воздействию механического, теплового и окислительного стрессов, которые приводят к образованию в саркомерах поврежденных белков, в том числе филамина С. Это обуславливает высокую потребность мышечных клеток в поддержании протеостаза, которое осуществляется посредством рефолдинга и деградации поврежденных белков. Рефолдинг опосредуют шапероны, такие как белки теплового шока; деградация может осуществляться по убиквитин-протеасомному пути, либо по механизму шаперон-опосредованной селективной аутофагии (CASA, или BAG3-опосредованная аутофагия), благодаря которому, в частности, происходит деградация поврежденного филамина С. Такие механизмы не исключают друг друга. Интересно, что в модели FLNC-опосредованной миопатии у D. rerio была показана колокализация агрегатов мутантного филамина С с шапероном BAG3, при этом такие агрегаты не подвергались CASA-деградации. Вероятно, наличие не удаляемых из саркомеров агрегатов филамина С может смещать протеостатическое равновесие в сторону увеличения количества поврежденных белков Z-дисков и повышения уровня их экспрессии для компенсации сократительной функции клеток. Однако, подобные механизмы нарушения протеостаза и развития протеотоксичности в кардиомиоцитах с мутациями гена FLNC остаются неизученными. Неизвестно, какой вклад вносит накопление агрегатов филамина С и поврежденных белков саркомеров в повышение жесткости и снижение пластичности миокарда у пациентов с РКМП. В связи с этим, настоящий проект направлен на изучение влияния патогенной гетерозиготной мутации c.7416_7418delGAA/p.Glu2472_Asn2473delAsp гена FLNC на аутофагию и работу протеасомной системы белковой деградации на модели пациент-специфичных кардиомиоцитов in vitro. Раскрытие механизмов, опосредующих влияние мутаций гена FLNC на работу кардиомиоцитов, необходимо как для понимания причин дисфункции миокарда на клеточном уровне, так и для поиска новых диагностических маркеров и разработки способов таргетной терапии в данной группе пациентов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Лаврентьева К.А., Богомолова А.П., Катруха И.А., Голиусова Д.В., Богомазова А.Н. Подбор способа созревания кардиомиоцитов, дифференцированных из ИПСК человека, для получения релевантной клеточной модели кардиомиопатии СТУДЕНЧЕСКИЙ БИОХИМИЧЕСКИЙ ФОРУМ – 2024. IV межвузовская студенческая конференция: 30, 31 марта и 1 апреля 2024 г., Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет. Материалы конференции, СТУДЕНЧЕСКИЙ БИОХИМИЧЕСКИЙ ФОРУМ – 2024. IV межвузовская студенческая конференция: 30, 31 марта и 1 апреля 2024 г., Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет. Материалы конференции/ Отв. ред. А.Г. Катруха. Сост. В.М. Шатов // С. 52 (год публикации - 2024)

2. Голиусова Д.В., Лебедева О.С., Шарикова М.Ю., Копылова И.В., Терякова М.В., Лаврентьева К.А., Зеркаленкова Е.А., Богомазова А.Н., Лагарькова М.А. ПОЛУЧЕНИЕ ЛИНИИ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК RCPCMi011-A ИЗ ФИБРОБЛАСТОВ ПАЦИЕНТА С РЕСТРИКТИВНОЙ КАРДИОМИОПАТИЕЙ, АССОЦИИРОВАННОЙ С МУТАЦИЕЙ c.7416_7418delGAA В ГЕНЕ FLNC Онтогенез / Russian Journal of Developmental Biology (год публикации - 2025)

3. Голиусова Д.В., Шарикова М.Ю., Лаврентьева К.А., Емец Е.В., Лебедева О.С., Богомазова А.Н., Лагарькова М.А. Моделирование рестриктивной кардиомиопатии с использованием ИПСК человека Сборник тезисов. Международный Конгресс «VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 300‑летию российской науки и высшей школы». Саратов, 14–19 июня 2024 года | INTERNATIONAL CONGRESS “VIII Congress of the Vavilov Society of Geneticists and Breeders, dedicated to the 300th anniversary of Russian science and higher education” Saratov, June 14–19, 2024 Издательский дом «Петрополис», Санкт‑Петербург, 2024. — 804 с., Международный Конгресс «VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 300‑летию российской науки и высшей школы». Саратов, 14–19 июня 2024 года | INTERNATIONAL CONGRESS “VIII Congress of the Vavilov Society of Geneticists and Breeders, dedicated to the 300th anniversary of Russian science and higher education” Saratov, June 14–19, 2024 Издательский дом «Петрополис», Санкт‑Петербург, 2024. — 804 с. // С. 272 (год публикации - 2024)

4. Голиусова Д.В., Шарикова М.Ю., Лаврентьева К.А., Лебедева О.С., Муранова Л.К., Гусев Н.Б., Богомазова А.Н., Лагарькова М.А. Role of Filamin C in Muscle Cells Pleiades Publishing, Ltd., ISSN 0006-2979, Biochemistry (Moscow), 2024, Vol. 89, No. 9, pp. 1546-1557 © Pleiades Publishing, Ltd., 2024. (год публикации - 2024)
10.1134/S0006297924090025

5. Голиусова Д.В., Богомолова А.П., Лаврентьева К.А., Шарикова М.Ю., Давиденко А.В., Зеркаленкова Е.А., Богомазова А.Н., Лагарькова М.А., Катруха И.А., Лебедева О.С. КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СОЗРЕВАНИЯ КАРДИОМИОЦИТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ИПСК ЧЕЛОВЕКА, СТИМУЛИРУЕТ ЭКСПРЕССИЮ СЕРДЕЧНОЙ ИЗОФОРМЫ ТРОПОНИНА И Гены и Клетки (год публикации - 2025)

6. Шарикова М.Ю., Голиусова Д.В., Лебедева О.С., Богомазова А.Н. Анализ экспрессии гена FLNC в клеточной модели FLNC-ассоциированной рестриктивной кардиомиопатии СТУДЕНЧЕСКИЙ БИОХИМИЧЕСКИЙ ФОРУМ – 2024. IV межвузовская студенческая конференция: 30, 31 марта и 1 апреля 2024 г., Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет. Материалы конференции/ Отв. ред. А.Г. Катруха. Сост. В.М. Шатов, СТУДЕНЧЕСКИЙ БИОХИМИЧЕСКИЙ ФОРУМ – 2024. IV межвузовская студенческая конференция: 30, 31 марта и 1 апреля 2024 г., Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет. Материалы конференции/ Отв. ред. А.Г. Катруха. Сост. В.М. Шатов // C. 76 (год публикации - 2024)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
На второй год работы мы провели валидацию части полученных результатов аллель-специфичной количественной ОТ-ПЦР методом высокопроизводительного параллелльного секвенирования на платформе Illuminа и установили, что изначально выбранный нами метод количественной оценки экспрессии аллелей FLNC имеет достаточно низкий порог чувствительности и не позволяет достоверно детектировать разницу значений в 15-20%. В связи с этим, по нашим данным метод количественной ОТ-ПЦР с зондами типа TaqMan не оптимален для оценки экспрессии аллелей гена FLNC. Основной научной задачей второго года работы являлось изучение механизмов влияния мутации c.7416_7418delGAA в гене FLNC на внутриклеточные процессы в кардиомиоцитах, а именно, на протеостаз и аутофагию. Мы провели предварительные эксперименты по оценке влияния ингибитора протеасом MG132 в разных концентрациях на аутофагию и выживаемость кардиомиоцитов для выбора оптимальной концентрации и срока экспозиции ингибитора для дальнейшей работы. Мы провели эксперименты по ингибированию протеасом в условиях 10 мкМ МG132 в течение 24 ч в кардиомиоцитах пациента (линии fil14, fil23) и здорового донора (линия ave2s) после культивирования клеток в среде, богатой метаболическими субстратами и способствующей созреванию. Мы показали, что полученные культуры высокогомогенны по экспрессии кардиомиоцит-специфичного маркера сердечного тропонина Т (сТнТ) и что интенсивность флуоресценции сТнТ) снижается после обработки клеток MG132. Анализ активности процессов аутофагии показал увеличение числа лизосом в кардиомиоцитах пациента по сравнению с контролем как до, так и после ингибирования протеасом, а также увеличение числа лизосом в кардиомиоцитах пациента после ингибирования протеасом, чего мы не наблюдали в здоровых кардиомиоцитах. Таким образом, мы продемонстрировали базовое повышение активности процессов аутофагии в кардиомиоцитах пациента с мутацией c.7416_7418delGAA в гене FLNC по сравнению со здоровыми кардиомиоцитами, а также показали компенсаторное повышение активности аутофагии в ответ на ингибирование протеасом в кардиомиоцитах при наличии мутации c.7416_7418delGAA в гене FLNC. Нам удалось детектировать поперечно-полостатую исчерченность саркомеров по FLNC и BAG3 в кардиомиоцитах после демаскирования антигенов при помощи нестандартного протокола фиксации клеток для иммуноцитохимического окрашивания, однако, мы не наблюдали явной агрегации FLNC в кардиомиоцитах пациента по сравнению с контролем. Мы не выявили значительных различий в интенсивности сигнала FLNC и BAG3 в окрашенных кардиомиоцитах пациента по сравнению с контролем как при ингибирования протеасом, так и без воздействия. Как и ожидалось, мы наблюдали повышение экспрессии BAG3 в условиях ингибирования протеасом как в контрольных кардиомиоцитах, так и в кардиомиоцитах пациента, что свидетельствует о компенсаторном усилении активности CASA-механизма для удаления дефектных белков. Тем не менее, наша гипотеза о компенсаторном повышении экспрессии гена BAG3 в кардиомиоцитах пациента по сравнению с контролем без воздействия не подтвердилась. Также мы выявили снижение уровня экспрессии генов ACTN2 и MYPN, кодирующих белки-партнеры филамина С, в одной линии кардиомиоцитов после ингибирования протеасом по сравнению с контролем. Мы показали, что при ингибировании протеасом в кардиомиоцитах с мутацией c.7416_7418delGAA в гене FLNC не происходит компенсаторного повышения уровня экспрессии гена FLNC по сравнению со здоровыми кардиомиоцитами. Наиболее значимыми научными результатами второго года работы являются экспериментальное опровержение агрегации филамина С и выявление нарушения компенсаторного стимулирования экспрессии FLNC, опосредованного BAG3, в условиях ингибирования протеасомы, т.е. накопления денатурированных и убиквитинированных белков, в кардиомиоцитах с мутацией c.7416_7418delGAA в гене FLNC, приводящей к развитию рестриктивной кардиомиопатии.

Публикации