Влияние МСК из жировой ткани и костного мозга мелких жвачных животных на качественные показатели их сперматозоидов до и после криоконсервации

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-26-00157

НазваниеВлияние МСК из жировой ткани и костного мозга мелких жвачных животных на качественные показатели их сперматозоидов до и после криоконсервации

Руководитель Корочкина Елена Александровна, Доктор ветеринарных наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт‑Петербургский государственный университет ветеринарной медицины» , г Санкт-Петербург

Конкурс №78 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-204 - Животноводство

Ключевые слова Мезенхимальные стволовые клетки, криоконсервация спермы, качественные показатели спермы козлов и баранов

Код ГРНТИ68.03.05

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Разведение мелких жвачных животных – баранов и коз, является одним из наиболее привлекательных и перспективных направлений в аспекте развития сектора крестьянско-фермерских хозяйств. Высокая скорость формирования стада за счет физиологических особенностей репродуктивной системы овец и коз, получение многопрофильных продуктов: высокоценного молока, молочной и мясной продукции, шерсти являются преимуществами данной отрасли и определяют ее высокую рентабельность. Данные подотрасли агропромышленного комплекса развиты в Северо-Кавказском (40% от общего поголовья), Южном (25%) и Сибирском (15,5%) округах нашей страны. По регионам на первом месте находится Дагестан, на втором – Ставрополье, на третьем – Калмыкия, на четвертом – Астраханская область. Лидером по численности поголовья овец и коз в Сибирском регионе является Республика Тыва. Как известно, успешное разведение животных возможно при наличии генетического разнообразия. Учитывая тенденцию мировой политики и экономики на сегодняшний день, первостепенной задачей для возможности дальнейшего развития данной отрасли является сохранение существующих пород овец и коз, что возможно при наличии банка спермы и самого процесса криоконсервации спермопродукции высокоценных баранов и коз. Принимая во внимание репродуктивные особенности самок и самцов мелких жвачных животных, а также основные факторы, влияющие на успешность искусственного осеменения, актуальным является поиск с дальнейшим изучением методов повышения качественных характеристик спермы до и после криоконсервации. Проводя анализ литературных данных касательно андрологической патологии самцов, а также способов повышения качества спермы после криоконсервации, особый интерес вызывает применение мезенхимальных стволовых клеток как способа улучшения воспроизводительной способности самцов. Согласно полученным данным некоторых исследователей, использование МСК, полученных из пуповины, жировой ткани и костного мозга, показали лучшие результаты восстановления фертильности спермы самцов. Hajihoseini M, Vahdati A. (2017), Mehrabani D, Hassanshahi M.A. (2015) было проведено исследование по влиянию МСК, полученных из костного мозга (BM-MSCs), и МСК, полученных из жировой ткани (AD-MSCs), на индуцированную азооспермию крыс. Panahi M., Keshavarz S. (2015) после инъекции бусульфана для индукции азооспермии, крысам вводили МСК в семенники. Через 2 месяца семенники, в которые были введены МСК, стали морфологически нормальными. Сперматогенез был обнаружен не в каждом, а только в некоторых канальцах получивших стволовые клетки семенников. В некоторых исследованиях была описана транс-дифференцировка МСК в сперматогенетические клетки при создании необходимых условий (C. Cakici, B. Buyrukcu, 2013). В исследованиях Kim T.H. (2018), МСК оказывали положительное влияние на поражения, вызванные химиотерапией, преждевременную недостаточность яичников и синдром поликистозных яичников. Положительные результаты могут быть объяснены, по крайней мере частично, влиянием МСК на клетки гранулезы, а также их противовоспалительным, антиапоптотическим и регенеративным действием и потенциальными паракринными действиями [M. Yang, et al., 2020]. Учитывая все вышесказанное, целью данного проекта является изучение влияния МСК мелких жвачных животных на качественные показатели спермы до и после криоконсервации. В связи с этим задачами проекта будут являться разработка протоколов выделения МСК из жировой ткани и костного мозга баранов и козлов; исследование влияния мезенхимальных стволовых клеток на показатели нативных образцов спермы баранов и козлов; оценка возможности применения МСК в качестве компонента криозащитной или реабилитационной среды; разработка теоретических и практических подходов к повышению сохранности и оплодотворяющей способности сперматозоидов с учетом использования выделения МСК из жировой ткани и костного мозга баранов и козлов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Корочкина Е.А., Финагеев Е.Ю., Ивановская М.М. Оценка морфологии сперматозоидов баранов с помощью набора быстрого дифференцированного окрашивания Диахим-Дифф-Квик Ветеринария, Ветеринария. - № 7. - С. 38-42. (год публикации - 2023)
10.30896/0042-4846.2023.26.7.38-42

2. Корочкина Е. А., Финагеев Е. Ю., Главацкая Д. Е.,. Пушкина В. С. Качество спермы баранов до и после криоконсервации Ветеринария, Ветеринария. – 2023. – № 8. – С. 34-38. (год публикации - 2023)
10.30896/0042-4846.2023.26.8.34-38

3. Корочкина Е. А., Трифонова А.В., Ивановская М.М., Финагеев Е. Ю., Главацкая Д. Е.,. Пушкина В. С. Влияние МСК из жировой ткани и костного мозга баранов на качественные показатели их сперматозоидов Ветеринария, Ветеринария. - 2024. - № 1 (год публикации - 2024)

4. Корочкина Е.А., Никитин В.В., Мороз А.И., Главацкая Д.Е., Пушкина В.С. Оценка качественных показателей эпидидимальной спермы козлов до и после криоконсервации Ветеринария и кормление, Ветеринария и кормление. - № 7. - 2023. - С.30-32 (год публикации - 2023)
10.30917/ATT-VK-1814-9588-2023-7-7

5. Корочкина Е. А., Трифонова А.В., Финагеев Е. Ю., Главацкая Д. Е.,. Пушкина В. С. Качественные показатели спермы козлов-производителей до и после криоконсервации Международный вестник ветеринарии, Международный вестник ветеринарии. -№ 4. - 2023. (год публикации - 2023)
10.52419/issn2072-2419.2023.4.337

6. Корочкина Е. А., Трифонова А.В., Финагеев Е. Ю., Главацкая Д. Е.,. Пушкина В. С. Влияние мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани и костного мозга козлов на качественные показатели их сперматозоидов Международный вестник ветеринарии, № 4. - 2023. (год публикации - 2023)
10.52419/issn2072-2419.2023.4.405

7. Корочкина Е. А., Финагеев Е.Ю., Главацкая Д.Е., Пушкина В.С. 2. Сравнение методов морфологической оценки сперматозоидов баранов с использованием набора SPERM BLUE и окрашивания по Романовскому-Гимзе Международный вестник ветеринарии, № 1. – С. 350-355. (год публикации - 2024)
10.52419/issn2072-2419.2024.1.350

8. Корочкина Е.А., Главацкая Д.Е., Пушкина В.С. Динамика значений кинематических показателей подвижности сперматозоидов баранов в процессе криоконсервации при использовании различных средовых компонентов Сборник научных трудов Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы ветеринарной репродуктологии и современные пути их решения", С.132-139 (год публикации - 2024)

9. Корочкина Е. А., Пушкина В.С. Влияние мезенхимальных стромальных клеток на качество спермы баранов после криоконсервации Ветеринария и кормление, № 4. – С. 55-59. (год публикации - 2024)
10.30917/ATT-VK-1814-9588-2024-4-10

10. Корочкина Е. А., Трифонова А.В., Финагеев Е.Ю., Пушкина В.С., Главацкая Д.Е. 4. Влияние компонентов мезенхимальных стволовых клеток козлов на качественные показатели сперматозоидов Ветеринария и кормление, № 2. – С. 40-44. (год публикации - 2024)
10.30917/ATT-VK-1814-9588-2024-2-9

11. Корочкина Е. А., Пушкина В.С., Главацкая Д.Е., Трифонова А.В. Эффективность применения мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани и костного мозга как компонента разбавителя для криоконсервации спермы козлов-производителей Ветеринария (год публикации - 2025)

12. Корочкина Е. А., Финагеев Е.Ю., Пушкина В.С., Главацкая Д.Е., Трифонова А.В. 5. Использование мезенхимальных стромальных клеток при криоконсервации спермы баранов-производителей Ветеринария, № 11. – С. 43-47. (год публикации - 2024)
10.30896/0042-4846.2024.27.11.43-47.

13. Корочкина Е.А., Трифонова А.В., Финагеев Е.Ю., Пушкина В.С., Главацкая Д.Е. Влияние лизата мезенхимальных стволовых клеток (МСК) баранов на качественные показатели сперматозоидов Вестник КрасГАУ (год публикации - 2024)

14. Корочкина Е. А., Трифонова А.В., Нечаев А.Ю., Пушкина В.С., Главацкая Д.Е. 1. Влияние кондиционированной среды мезенхимальных стромальных клеток баранов на качественные показатели сперматозоидов Международный вестник ветеринарии, № 2. – С. 276-284. (год публикации - 2024)
10.52419/issn2072-2419.2024.2.276

15. Корочкина Е.А., Трифонова А.В., Финагеев Е.Ю., Главацкая Д.Е.,Пушкина В.С. Эффективность использования мезенхимальных стволовых клеток после криоконсервации спермы козлов-производителей Международный вестник ветеринарии (год публикации - 2024)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
1. Был отработан протокол получения МСК из внутреннего и подкожного жира животных, а также фрагментов ребер обоих видов, который позволил получать культуры МСК ЖТ и МСК КМ мелкого рогатого скота. 2. Было проведено изучение роста культур МСК из жировой ткани и костного мозга баранов и козлов при длительном культивировании, построены кривые роста для каждого вида животных, описана морфология МСК на разных сроках культивирования. 3. Были показаны особенности культур МСК в зависимости от вида животного, источника выделения и длительности культивирования. 4. Было показано отсутствие существенных индивидуальных отличий МСК между видами животных и донорами по их способности к направленной дифференцировке в адипо и остеогенном направлениях, а также отсутствию спонтанной дифференцировки на разных сроках культивирования. 5. Было установлено положительное влияние компонентов МСК (лизат (КР) и кондиционированная среда (КС)) из жировой ткани и костного мозга на качество спермы баранов. Эффективным протоколом использования КС МСК ЖТ/КМ для спермы баранов/козлов является соотношение 1:1 при концентрации сперматозоидов баранов - 7х1010кл/мл, использования КР МСК ЖТ/КМ - 2х108кл/мл и сперматозоиды 7х1010кл/мл. Количество прогрессивно двигающихся сперматозоидов, в процессе трехчасовой инкубации в КС КМ составляет 40,71±10,20% (p<0,01), ЖТ –32,95±10,92% (p<0,01) соответственно. В процессе часовой инкубации сперматозоидов в КС МСК КМ наблюдалось достоверное сокращение количества нормальных сперматозоидов в 1,2 раза (p=0,04), а также увеличение количества сперматозоидов с дефектами головок (p=0,03, 2 часа инкубации). Количество нормальных сперматозоидов в процессе трехчасовой инкубации в КС МСК ЖТ составило 28,20±7,53% (p=0,01). Инкубация спермы баранов в средах, содержащих КР МСК ЖТ/КМ в течение 3-х часов при температуре 37ºС способствует достоверному сохранению жизнеспособности сперматозоидов с наличием следующих морфофункциональных характеристик: прогрессивность движения – 43,10±6,86% (p<0,01, КР МСК КМ), 38,31±7,76% (p<0,01, КР МСК ЖТ); количество нормальных сперматозоидов 39,40±2,40%(p<0,01, КР МСК ЖТ), количество сперматозоидов с дефектами головок: 12,10±1,53% (p<0,01, КР МСК КМ) и 13,90±2,14% (p≤0,05, КР МСК ЖТ). 5. Было установлено, что сперматозоиды козлов сохраняют жизнеспособность в процессе трехчасовой инкубации (температура 38ºС) в средах, содержащих КР и КС МСК, имеют следующие показатели: прогрессивность движений 57,70±8,24% - 51,44±10,55% / 38,80±8,52% - 41,50±10,23%, количество морфологически нормальных сперматозоидов 51,10±2,55% - 46,30±5,24% / 51,10±2,64% - 48,50±1,73% (КР МСК КМ / ЖТ и КС МСК КМ/ЖТ соответственно). КР и КС МСК КМ, обладают выраженным протекторным действием на клеточную структуру в процессе трехчасовой инкубации (количество нормальных сперматозоидов 51,10±2,55% и 51,10±2,64%, 3 часа инкубации, p≤0,05). Среды, содержащие КР МСК ЖТ имеют выраженный краткосрочный положительный эффект на переживаемость сперматозоидов и их морфологическую структуру (64,80±2,42%, 1 час инкубации,p<0,01). 6. Было изучено влияние МСК из жировой ткани и костного мозга баранов на качественные показатели спермы до и после криоконсервации: 6.1. был установлен выраженный регенеративный эффект МСК на структуру сперматозоидов после оттаивания, при этом наибольшее количество морфологически нормальных сперматозоидов было зарегистрировано через 2 часа инкубации с разбавителем и МСК КМ (38,40±2,25%), через 4 часа при инкубации с разбавителем и МСК ЖТ (36,00±2,61%); определено повышение активности сперматозоидов после оттаивания при использовании МСК из жировой ткани в качестве компонента разбавителя (29,90±6,96%); зарегистрировано выраженное восстановление двигательной способности сперматозоидов на 2-й час инкубации после оттаивания как при использовании МСК КМ (36,60±4,60%), так и МСК ЖТ (34,84±6,16%) по сравнению со значением контрольной группы (28,91±5,04%); 6.2. был установлен положительный эффект применения МСК КМ в аспекте восстановления морфофункциональных характеристик сперматозоидов после криоконсервации, Добавление МСК ЖТ/КМ в сперму баранов после оттаивания способствует сохранению двигательной активности, структурной целостности и жизнеспособности половых гамет в процессе шестичасовой инкубации (температура 38ºС) после криоконсервации в средах, содержащих разбавитель OptiXcell и МСК ЖТ/КМ. При этом разница значений 2, 4 и 6 часов инкубации по сравнению с показателями 0 часов составила: в контрольной группе (OptiXcell) 1,2 (p<0,01), 1,3 (p<0,01), 2,1 (p<0,01) раз; в первой опытной группе (OptiXcell + МСК КМ) – 1,3 (p<0,01), 1,5 (p<0,01), 2,1(p<0,01) раз; во второй опытной группе (OptiXcell + МСК ЖТ) – 1,2 (p<0,01), 1,5 (p<0,01), 2,1 (p<0,05) раз соответственно. Был зафиксирован выраженный регенеративный эффект МСК КМ на функциональную целостность размороженных сперматозоидов на 4-й и 6-й часы инкубации: увеличение количества прогрессивно двигающихся сперматозоидов на 15,25% (6-й час, p<0.01), а также увеличение количества нормальных сперматозоидов на 3,41% с одновременным сокращением количества сперматозоидов с дефектами хвостов на 6,49% (4-й час, p<0.01) соответственно. 7. Было констатировано воздействие МСК из жировой ткани и костного мозга козлов на качественные показатели спермы до и после криоконсервации: 7.1.Было установлено, что МСК ЖТ/КМ козлов обладают криопротекторными свойствами и пригодны для использования в качестве компонента среды-разбавителя для криоконсервации спермы. При этом наиболее эффективными являются МСК ЖТ. Использование разбавителя OptiXcell с МСК способствуют сохранению морфологической целостности сперматозоидов козлов-производителей после оттаивания: количество морфологически нормальных сперматозоидов составило 55,50±3,65% (МСК ЖТ) и 53,10±3,60% (МСК КМ), общая подвижность - 46,00±7,30% (МСК ЖТ) и 44,10±6,31% (МСК КМ). 7.2. Переживаемость сперматозоидов козлов после оттаивания составляет 4 часа. Наиболее эффективным протоколом является инкубация спермы козлов после оттаивания с МСК из костного мозга в течение 2-4 часов. При этом установлено: 1. сохранение морфологически нормальных сперматозоидов, их количество на 4-й час инкубации составляет 46,00±1,98%; 2. сохранение двигательной активности на 4-й час инкубации, равной 21,45±4,58% с достоверной наименьшей разницей между значениями внутри группы – 2,0 раза ((p<0,01); 3. сперматозоиды козлов сохраняют жизнеспособность с течение 4-х часов инкубации, непосредственно после оттаивания образцов. При этом наибольшее количество жизнеспособных сперматозоидов отмечается при инкубации спермы с МСК из КМ (37,13±2,21%).

Публикации

Возможность практического использования результатов
Данный проект соответствует комплексу мер, направленных на создание и внедрение до 2031 года конкурентоспособных отечественных технологий, основанных на новейших достижениях науки, указанных в пункте 1 Указа Президента Российской Федерации от 21.07.2016 № 350 «О мерах по реализации государственной научно-технической политики в интересах развития сельского хозяйства» (в частности соответствует пунктам 1.а - производство оригинальных и элитных семян сельскохозяйственных растений, племенной продукции (материала) по направлениям отечественного растениеводства и племенного животноводства, имеющим в настоящее время высокую степень зависимости от семян или племенной продукции (материала) иностранного производства; 1.д - контроль качества сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия и экспертизу генетического материала). Результаты проведенных исследований имеют производственное значение для таких отраслей животноводства как овцеводство и козоводство. В результате проведенных исследований: 1.усовершенствован протокол криоконсервации спермы баранов и козлов (ручная заморозка) с использованием минимального набора инструментов (центрифуга (для удаления семенной плазмы), холодильник (для охлаждения), сосуд Дьюара с жидким азотом (для заморозки), криолинейка (для измерения уровня жидкого азота), криоштативы, криосоломины); 2. установлена эффективность применения МСК и их производных как криопротекторного и регенеративного компонента разбавителя для спермы баранов и козлов производителей, что в дальнейшем позволит разработать оптимальный состав разбавителя для криоконсервации спермы баранов и козлов-производителей. Оптимизация протокола криоконсервации спермы баранов и козлов-производителей с использованием эффективного разбавителя, обладающего высоким криопротекторным потенциалом, позволит использовать искусственное осеменение овец и коз и, как следствие, масштабировать данные животноводческие отрасли.