Экзогенные дцРНК для регуляции свойств растений: эффективность подхода и эпигенетические последствия.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-26-00253

НазваниеЭкзогенные дцРНК для регуляции свойств растений: эффективность подхода и эпигенетические последствия.

Руководитель Дубровина Александра Сергеевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Федеральный научный центр Биоразнообразия наземной биоты Восточной Азии» Дальневосточного отделения Российской академии наук , Приморский край

Конкурс №78 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-106 - Растениеводство

Ключевые слова Двухцепочечные РНК (дцРНК), экзогенные РНК, замолкание генов, РНК-интерференция, короткие интерферирующие РНК (киРНК), регуляция экспрессии генов растений, Solanum lycopersicum, Arabidopsis thaliana, Vitis amurensis, стильбены, антоцианы.

Код ГРНТИ62.00.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В области получения трансгенных растений достигнут значительный успех, поскольку многочисленные исследования показывают, что таким образом можно не только ввести чужеродные гены в геном растения для продукции целевых белков, но и отрегулировать уровень экспрессии собственных генов растения, что в итоге может сказаться на увеличении продукционных характеристик трансгенных растений. Однако в нашей стране и в большинстве Европейских стран законодательно запрещено или наложены ограничения на получение и выращивание генно-модифицированных организмов (ГМО). Это объясняется тем, что в настоящее время многое остается неизвестным о последствиях вмешательства в структуру генома растения, что вызывает дискуссии о безопасности ГМО. Таким образом, разработка новых экологически чистых подходов для изменения различных характеристик растений, без модификации их генома, является чрезвычайно актуальной задачей. Известно, что в процессе РНК-интерференции или замолкания (сайленсинга) генов, который открыт более 15 лет назад, двухцепочечные РНК (дцРНК) подвергаются процессингу специализированными ферментами (DICER LIKE или DCL) и нарезаются на короткие интерферирующие РНК (киРНК), которые затем включаются в работу РНК-индуцируемого комплекса белков, обеспечивающего деградацию любых молекул РНК схожих с дцРНК. В результате разрушаются мРНК тех генов, к которым малые РНК имеют значительную гомологию, и экспрессия этих генов снижается. Недавно в научной литературе стали появляться интригующие сообщения о возможности индукции процессов РНК-интерференции, снижения экспрессии целевых генов грибковых и вирусных патогенов растений и увеличения защитных свойств растений с помощью достаточного простого опрыскивания поверхности растений растворами дцРНК, которые были сконструированы для инактивации работы жизненно важных генов патогенов растений. Установлено, что экзогенно примененные синтетические дцРНК и киРНК, способны проникать в сосудистую систему растения и непосредственно в клетки растения, после чего индуцируют процесс РНК-интерференции. Последние исследования сообщают об ингибирующем действии экзогенных дцРНК и киРНК на экспрессию трансгенов и эндогенных генов самого растения. Благодаря нашим исследованиям и исследованиям других ученых, был предложен подход для быстрого влияния на свойства растений без вмешательства в их геном с помощью экзогенных дцРНК или киРНК. В целом данное направление только начинает развиваться и в литературе наблюдается крайне небольшое число сообщений о регуляции экспрессии эндогенных генов или трансгенов растений с помощью экзогенных дцРНК или киРНК, ведущих к изменению свойств растения в желаемом направлении. Преобладающее большинство описанных данных было получено на модельном растении резуховидке Таля Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. или табаке Nicotiana benthamiana L., которые не используются в сельском хозяйстве. Активные исследования в данном направлении чрезвычайно актуальны не только для дальнейшего исследования механизмов функционирования РНК-интерференции, усовершенствования описанного подхода и его апробации в нашей стране, но и для исследования возможности применения накопленного опыта в сельском хозяйстве. Настоящий проект посвящен исследованию влияния экзогенных дцРНК на экспрессию генов растений ценных для сельского хозяйства (томат, виноград) с целью индукции процессов РНК-интерференции и изменения свойств растений в желаемом направлении. Кроме того, при выполнении проекта планируется провести исследования, направленные на повышение эффективности и изучение эпигенетических последствий применения экзогенных дцРНК. Настоящий проект несет значительную научную новизну и актуален для получения важных результатов для развития сельского хозяйства и исследования молекулярно-генетических последствий применения нового подхода.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Дубровина А.С. Регуляция биосинтеза антоцианов с помощью внешней обработки растений двуцепочечными РНК Тезисы докладов Школы молодых ученых "Новые биотехнологии в функциональной геномике, растениеводстве и защите растений", Т. 1, с. 10 (год публикации - 2023)

2. Дубровина А.С.,Супрун А.Р., Киселев К.В. Simultaneous application of five exogenous dsRNAs for the regulation of anthocyanin metabolism-related genes and anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis thaliana Тезисы докладов VII Международной научной конференции «Генетика, Геномика, Биоинформатика и Биотехнология растений», Т.1, с. 112 (год публикации - 2023)

3. Супрун А.Р., Киселев К.В., Дубровина А.С. Exogenous double-stranded RNAs for regulation of anthocyanin accumulation in tomato Solanum lycopersicum Тезисы докладов VII Международной научной конференции «Генетика, Геномика, Биоинформатика и Биотехнология растений», Т.1, с. 393 (год публикации - 2023)

4. Супрун А.Р., Киселев К.В., Дубровина А.С. Exogenously induced silencing of four MYB transcription repressor genes and activation of anthocyanin accumulation in Solanum lycopersicum International Journal of Molecular Sciences, 24(11), 9344 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24119344

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
1) Установлено, что экзогенное нанесение AtCHS-дцРНК на розеточные листья A. thaliana вызывает значительные количественные и качественные изменения в профиле микроРНК, в то время как NPTII-дцРНК оказывают минимальное влияние. Обнаружено 60 дифференциально экспрессируемых микроРНК из 428 обнаруженных микроРНК. 59 микроРНК были значительно изменены после обработки AtCHS-дцРНК по сравнению с водой и NPTII-дцРНК и 1 микроРНК была значительно изменена после обработки AtCHS-дцРНК и NPTII-дцРНК по сравнению с обработкой водой. Экспрессия 35 микроРНК снижалась под воздействием AtCHS-дцРНК, а 24 микроРНК были активированы под воздействием AtCHS-дцРНК. Подтверждены несколько предсказанных генов-мишеней для дифференциально экспрессированных микроРНК, включая гены APETALA2, SCL27, SOD1, GRF1, AGO2, PHB и PHV. Анализ показал отрицательную корреляцию между экспрессией микроРНК и экспрессией их предполагаемых мишеней. Таким образом, экзогенные дцРНК, специфичные для генов растений, вызывают существенные изменения в общем составе микроРНК растений, что в конечном итоге влияет на экспрессию широкого спектра генов. Опубликована статья (Nityagovsky et al. 2024). 2) Проанализирован уровень метилирования ДНК по цитозину гена AtCHS A. thaliana с помощью бисульфитного секвенирования после нанесения на поверхность растений растворов дцРНК. Оценивали уровень метилирования ДНК, соответствующей тому же участку, под который подбирали AtCHS-дцРНК для экзогенной обработки растений (3’-концевая область гена 292 пн). Под воздействием антоциан-индуцирующих стрессовых условий на растения уровень метилирования гена AtCHS значительно снижался во всех пробах, особенно в контроле (вода) 61%, по сравнению с контрольными условиями, но это снижение было значительно менее выраженном при обработке растений AtCHS-дцРНК (88%) и NPTII-дцРНК (75%). Необходимо также отметить, что мы наблюдали более выраженное сдерживание падения метилирования под воздействием AtCHS-дцРНК (88%), чем под воздействием NPTII-дцРНК (75%) и водой (61%). Анализ распределения метилирования по сайтам метилирования (CG, CHG, CHH) показал, что AtCHS-дцРНК и NPTII-дцРНК не оказывают существенного влияния. 3) Экзогенные VaMyb1-дцРНК приводят к увеличению уровня содержания стильбенов в V. amurensis через ингибирование экспрессии гена VaMyb1, но в целом обработка культур клеток V. amurensis дцРНК против гена VaMyb1 дала небольшой результат. Дополнительное варьирование условиями для обработки каллусов и листьев V. amurensis не дало значительного эффекта, содержание стильбенов и экспрессия гена VaMyb1 возрастали, но в целом довольно слабо. Обработка каллусов VaMyb1-дцРНК снижала экспрессию гена VaMyb1 и активировало содержание стильбенов до 1.3 и 1.2 раз, соответственно. Содержание стильбенов возрастало с 2.1 до 4.9 мг/г сухой биомассы, что является относительно небольшим стимулирующим эффектом. Более интересные результаты показала обработка листьев отрезков лианы винограда дцРНК против гена VaMyb1. В отличие от эксперимента с культурами клеток эффект уменьшения уровня экспрессии гена VaMyb1 наблюдался как на 3-й, так и на 7-й день после обработки по сравнению с листом, обработанным водой. По полученными результатам подготовили статью к публикации в реферируемом издании. 4) Результаты продемонстрировали значительное подавление экспрессии всех пяти генов-мишеней арабидопсиса AtCPC, AtMybL2, AtANAC032, AtCBP60g, AtBAN и томата SlMyb76, SlMyb32, SlMybATV и SlTRY экзогенными дцРНК, применяемыми как по отдельности, так и в смеси, что привело к усилению экспрессии гена халконсинтазы (CHS) и увеличению содержания антоцианов. Одновременное применение пяти дцРНК в смесях значительно снижало экспрессию генов-мишеней AtANAC032, AtCBP60g, AtCPC, AtMYBL2 и AtBAN и значительно активировало накопление антоцианов в 2-3 раза, до 0,3 мг/г сырой массы. Применение ДЦРНК в смесях активировало накопление антоцианов более эффективно, чем любая из этих дцРНК по отдельности. Сходные результаты получены для SlMyb76, SlMyb32, SlMybATV и SlTRY томата. Опубликована статья (Kiselev et al. 2024 Plants). 5) Проведен анализ экзогенно-индуцированного сайленсинга гена SlTRY томата S. lycopersicum с помощью дцРНК, кодирующих рвзличные области SlTRY: промоторную, белок-кодирующую и интронную. Анализ экспрессии гена SlTRY под воздействием дцРНК-Prom1 (кодирует промотор), дцРНК-Prom2 (промотор и начало кодирующей области), дцРНК-Intr (интрон) и дцРНК-TRY (кодирующая область) продемонстрировало критическую важность выбора соответствующей области гена-мишени для воздействия экзогенными дцРНК на растение. Наибольшее ингибирование экспрессии гена SlTRY, активация генов биосинтеза из фенилпропаноидного пути и активация биосинтеза антоцианов были достигнуты с помощью дцРНК, комплементарной белок-кодирующей области гена SlTRY. Подавление гена SlTRY увеличивало содержание антоцианов и повышало уровень других веществ фенилпропаноидного пути. Интересно, что дцРНК-Intr (интрон), наоборот, активировала экспрессию гена SlTRY, не влияя при этом на содержание антоцианов. В будущем мы планируем проверить этот результат на других генах томата и объяснить его причины. Опубликована статья (Suprun et al. 2024 Plants).

Публикации

1. Нитяговский Н.Н., Киселев К.В. , Супрун А.Р., Дубровина А.С. Impact of Exogenous dsRNA on miRNA Composition in Arabidopsis thaliana Plants, 13(16), 2335 (год публикации - 2024)
10.3390/plants13162335

2. Киселев К.В., Супрун А.Р., Алейнова О.А., Огнева З.В., Дубровина А.С. Simultaneous Application of Several Exogenous dsRNAs for the Regulation of Anthocyanin Biosynthesis in Arabidopsis thaliana Plants, 13(4), 541 (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.3390/plants13040541

3. Suprun A.R., Manyakhin A.Y., Trubetskaya E.V., Kiselev K.V., Dubrovina A.S. Regulation of Anthocyanin Accumulation in Tomato Solanum lycopersicum L. by Exogenous Synthetic dsRNA Targeting Different Regions of SlTRY Gene Plants, 13(17), 2489 (год публикации - 2024)
10.3390/plants13172489

Возможность практического использования результатов
Проект показал возможность регуляции свойств различных растений, в т.ч. важных сельско-хозяйственных культур, с помощью простого внешнего применения двухцепочечных РНК для обработки поверхности растений. Этот подход может влиять на активность генов растений, открывает новые возможности для разработки новых научных методов и стратегий для повышения урожайности и совершенствования других характеристик растений в желаемом направлении. Полученные данные формируют научный и технологический задел для создания новой технологии, а именно направленного снижения экспрессии растительных генов с помощью внешней обработки растений препаратами дцРНК и киРНК. При дальнейшем развитии настоящая технология имеет значительный потенциал для практического применения в сельском хозяйстве как альтернатива трансгенным растениям или применению пестицидов.