Модуляция микробиома картофеля биостимулятором Rhodococcus qingshengii VKM Ac-2784D

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-26-10049

НазваниеМодуляция микробиома картофеля биостимулятором Rhodococcus qingshengii VKM Ac-2784D

Руководитель Петрушин Иван Сергеевич, Кандидат технических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук , Иркутская обл

Конкурс №76 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами» (региональный конкурс)

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-106 - Растениеводство

Ключевые слова Микробиом, эндосфера, ризосфера, картофель, R. qingshengii VKM Ac-2784D, геномика

Код ГРНТИ62.13.53

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Микробиом поддерживает рост и развитие растения, способствует адаптации к внешним условиям среды. Микроорганизмы, входящие в состав микробиома, образуют сложную трофическую цепь, характеризующуюся стабильностью и устойчивостью к изменению условий среды. Вмешательство в микробиом может привести к изменению этой структуры, что неблагоприятно скажется на жизнеспособности хозяина. Бактерии рода Rhodococcus являются типичными обитателями почвы и продуцируют большое количество биологически активных веществ: биосурфактанты, фитогормоны, сидерофоры, а также антимикробные соединения. В лаборатории растительно-микробных взаимодействий СИФИБР СО РАН ранее был выделен и охарактеризован штамм Rhodococcus qingshengii VKM Ac-2784D, обладающий способностью разрушать алканы и ПАУ (Беловежец и др., 2017, 2020), уменьшать неблагоприятное воздействие нефти на растения (Tretyakova et al., 2019). Мы предполагаем, что это связано с синтезом сурфактантов, удаляющих нефтяную пленку с поверхности корней, ауксинов, способствующих развитию корневой системы, а также цитокининов, приводящих к увеличению количества хлорофиллов и каротиноидов (Беловежец и др., 2021). Геном Rhodococcus qingshengii VKM Ac-2784D секвенирован и опубликован в NCBI GenBank (Petrushin et al., 2021). Его анализ с помощью программы antiSMASH определил наличие кластеров гомологичных генам кодирующим сидерофоры и антибиотики. Установлено, что данный штамм обладает лактоназной активностью, препятствующей чувству кворума бактерий. Мы предполагаем, что использование родококка в качестве биоудобрения должно оказывать существенное влияние на ассоциированные с растением микроорганизмы. Насколько сильным будет это влияние и может ли оно привести к значительному изменению микробиома картофеля мы планируем выяснить в данном исследовании. В процессе работы над проектом будет проведен сравнительный анализ микробиома картофеля, выросшего из клубней обработанных и не обработанных суспензией клеток R. qingshengii VKM Ac-2784D. С помощью экспериментов на растениях in vitro мы планируем выявить антагонизм между R. qingshengii VKM Ac-2784D и микроорганизмами ризо- и эндосферы картофеля классическими микробиологическими методами и при моделировании микробиома. Для изучения состава микробного сообщества будет проведено метагеномное секвенирование образцов, полученных из ризо- и эндосферы картофеля. В проекте мы оценим выживаемость R. qingshengii VKM Ac-2784D во внешней среде в качестве биоудобрения, распределение штамма по ризо- и эндосфере, создадим коллекция культивируемых эндофитных бактерий картофеля. Проделанная работа станет основой для следующих научных направлений: 1. Изучение микробиома картофеля в зависимости от внешних воздействий 2. Характеристика антибиотиков, синтезируемых R. qingshengii VKM Ac-2784D 3. Перспективность использования R. qingshengii VKM Ac-2784D в качестве биоудобрения сельскохозяйственных растений. Литература: Беловежец Л. А. et. al. Физико-химические свойства биосурфактантов, продуцируемых микроорганизмами-нефтедеструкторами // Химия в интересах уст. развития, 2021, №1, С. 21-26. DOI: 10.15372/KhUR2021273 Petrushin I. S. et. al. Complete Genome Sequence of Rhodococcus qingshengii Strain VKM Ac-2784D, Isolated from Elytrigia repens Rhizosphere //MRA. – 2021. – Т. 10. – №. 11. DOI: 10.1128/MRA.00107-21 Беловежец Л.А. et. al. Деструкция парафиновой фракции нефти микроорганизмами // Химия и технология топлив и масел, 2020, № 6, С. 25 – 29. Doi 10.1007/s10553-021-01208-z Tretyakova M. S. et. al. Possible use of oil-degrading microorganisms for protection of plants growing under conditions of oil pollution // IOP Conf. Series. –2019. –315. Р. 1-6. DOI: 10.1088/1755-1315/315/7/072046 Беловежец Л. А. et. al. Возможные пути деструкции ароматической составляющей нефти некоторыми видами бактерий-нефтедеструкторов выделенными из эндо и ризосферы растений // Прикл. биохимия и микробиология. – 2017. – Т. 53, № 1. – С. 76–81. DOI: 10.1134/S0003683817010069

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Мориц А.С., Петрушин И.С., Маркова Ю.А. Влияние Rhodococcus qingshngii VKM Аc-2784 D на эндо- и ризосферные микроорганизмы, выделенные из растений Solanum tuberosum сорта Луговской тезисы докладов VI Всероссийской научной конференции с международным участием "Устойчивость растений и микроорганизмов к неблагоприятным факторам среды". Иркутск, 2023, без номера, том VI, стр. 138 (год публикации - 2023)

2. Гутник Д.И., Петрушин И.С., Пушмина Е.О., Маркова Ю.А. Веб-приложение для анализа аннотаций геномов прокариот методами многомерной статистики и машинного обучения Proceedings of 11th Moscow Conference on Computational Molecular Biology MCCMB'23, August 3 - 6, 2023 Москва, Россия - М.: ИППИ РАН, 2023, ISBN: 978-5-901158-33-3, стр. 69 (год публикации - 2023)

3. Петрушин И.С., Филинова Н.В., Гутник Д.И. Potato microbiome: relationship with environment factors and approaches for microbiome modulation International Journal of Molecular Sciences (год публикации - 2023)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Посадка картофеля для повторного полевого эксперимента в сезоне 2024 г. была произведена в оптимальное время – 08.06.2024, осуществлялась традиционным методом, отступ между растениями не менее 40 см в ряду. Расстояние между рядом опытных и контрольных растений картофеля составляло не менее 100 см, для предотвращения перемешивания инокулированной биостимулятором R. qingshngii почвы. Одновременно с посадкой клубней картофеля были взяты пробы исходной почвы для определения исходного микробного сообщества почвы. На стадии цветения картофеля (02.08.2024) опытные растения повторно обработали 3-х суточной суспензией R. qingshngii VKM Ac – 2784 D путем проливания зоны корней. На данной стадии развития картофеля были зафиксированы различия морфофизиологических параметров опытных и контрольных растений. В это же время были отобраны пробы почвы в зоне ризосферы для анализа микробиома и листья для создания коллекции бактерий эндо- и ризосферы растений картофеля на стадии цветения. Во время сбора урожая (07.09.2024) произвели сбор клубней, снятие их морфометрических показателей (масса, размер и количество клубней в кусте), отбор проб почвы (зона геокаулосферы) для дальнейшего анализа микробиома и отбор растительных образцов для создания коллекции бактерий из эндосферы клубней картофеля. На этапе 2023 года нами установлено, что из всех выделенных эндофитных бактерий (ассоциированных с растением картофеля) наиболее высокой чувствительностью обладали 5 штаммов (7% от всех изолятов) с диаметром зоны подавления роста 18-22 мм, 17 штаммов (23%) обладали средней восприимчивостью (диаметр подавления роста – 14-18 мм) и 24 штамма (32%) показали слабую чувствительность. Остальные 28 изолятов проявляли устойчивость к метаболитам R. qingshengii. Одним из наиболее чувствительных штаммов являлся грамположительный спорообразующий изолят № 38. Инкубирование R. qingshengii VKM Ac-2784D и наиболее чувствительного к нему изолята №38 в среде роста растений картофеля Мурасиге-Скуга показало, что обе культуры способны к выживанию в данной среде, как в монокультуре, так и при совместном культивировании. При совместном культивировании, начиная с четвертых суток, родококк оказывал угнетающее воздействие на изолят № 38, которое продолжалось до девяти суток, как в среде роста, так и в эндосфере. В целом, результаты экспериментов показывают, что биопрепарат R. qingshengii VKM Ac-2784D способен оказывать модулирующее действие на компоненты микробиома картофеля, и фитотоксичной активности по отношению к картофелю не выявлено. В образцах почвы преобладали представители филумов Proteobacteria, Acidobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria и Bacillota. Предварительные данные указывают на то, что обработка суспензией клеток родококка привела к снижению содержания Proteobacteria и Bacteroidetes. Напротив, содержание Acidobacteria, Bacillota, Verrucomicrobia возросло. Данные по сезонам согласуются. В листьях преобладали протеобактерии и бактероиды. Причем у обработанных растений количество протеобактерий возрастало, а бактероидов, падало. Интересно, что в клубнях, напротив, возрастало количество протеобактерий. Альфа-разнообразие в образцах, обработанных биопрепаратом, повышалось как на стадии цветения, так и на стадии сбора урожая. Секвенирование (shotgun) ДНК образцов ризосферы контрольного растения и опытного растения выполнено в рамках договора НИР с ИХБФМ СО РАН. Для каждой пробы определён таксономический состав путем классификации программой Kraken2. Всего получено 234778 контигов с GC-составом 63.90%, из них только 4083 длиннее 1000 п.н, и только один участок длинее 5000 п.н. Несмотря на достаточно большое число прочтений (4-5 млн. штук на образец, 1200-1300 М.п.н.), имеющегося покрытия оказалось недостаточно для получения протяжённых участков (контигов) и группировки их в частичные геномы. Таксономический состав, определённый Kraken2 сопоставим с полученным в анализе ампликонов 16S. Перечень обнаруженных кластеров с указанием доли сходства с экспериментально подтверждёнными образцами приведён в таблице 2. Присутствие генов синтеза эктоина указывает на способность бактерий к осморегуляции (характерно для представителей Rhodococcus), что позволяет им адаптироваться к широкому спектру внешних условий при осмотическом стрессе. Синтез эктоина часто сочетается с синтезом трегалозы, соответствующие гены также содержатся в геноме R. qingshengii VKM Ac-2784D. Выработка ароматического каротиноида изорениератена позволяет бактерии нейтрализовать активные формы кислорода, повышает фотозащитные свойства и антиоксидантную активность, в том числе благодаря его более устойчивой к ультрафиолету форме в сравнении с другими каратеноидами. Для борьбы с конкурирующими бактериями штамм обладает необходимыми средствами. Так, тетрапептидные сидерофоры гидроксаматного типа (эритрохелин и коэлихелин) за счёт ингибирующего действия против Bacillus, Micrococcus spp. и Pseudomonas позволят получить преимущество в условиях дефицита железа. Аналогичную функцию выполняет гетеробактин, катехолатно-гидроксаматный сидерофор смешанного типа. Рассматриваемый штамм способен синтезировать и антибиотики, такие как ε-поли-лизин, представляющий собой нетоксичный и биоразлагаемый гомополипептид из микроорганизмов родов Streptomyces и Kitasatospora.

Публикации

1. Петрушин И.С., Маркова Ю.А., Мориц А.С., Гутник Д.И., Филинова Н.В. Microbiome manipulation of potato with biostimulator Rhodococcus qingshengii VKM Ac-2784D Материалы 14-й международной конференции "Биоинформатика регуляции и структуры геномов/системная биология", Новосибирск, Россия, 05–10 августа 2024 года, стр. 1457-1458, Материалы 14-й международной конференции "Биоинформатика регуляции и структуры геномов/системная биология", Новосибирск, Россия, 05–10 августа 2024 года, стр. 1457-1458 (год публикации - 2024)

2. Петрушин И.С., Маркова Ю.А., Мориц А.С., Гутник Д.И., Филинова Н.В. Исследование влияния биостимулятора Rhodococcus qingshengii VKM Ac-2784D на микробиом картофеля Материалы IV Международной научной конференции «Растения и микроорганизмы: биотехнология будущего» и III Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы адаптации микроорганизмов к различным условиям среды обитания». Иркутск, 2024, Материалы IV Международной научной конференции «Растения и микроорганизмы: биотехнология будущего» и III Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы адаптации микроорганизмов к различным условиям среды обитания». Иркутск, 2024 (год публикации - 2024)

3. Мориц А.С., Маркова Ю.А., Филинова Н.В., Петрушин И.С. Влияние биостимулятора Rhodococcus qingshengii VKM Ac-2784D на бактерии, выделенные из эндо- и ризосферы растений картофеля Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология, Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. Том 14, номер 4 (год публикации - 2024)
10.21285/achb.942