Аннотация результатов, полученных в 2024 году
На данной стадии проекта проводились исследования функционирования pH-чувствительного гибридного ДНК-аптамера in vitro относительно белка нуклеолина, влияния компонент конъюгатов ДНК-аптамера с производными фуллерена на выживаемость клеточных линий, а также структурно обусловленные закономерности, обуславливающие фотосенсибилизирующие способности производных фуллеренов С60 в водных растворах средствами компьютерного моделирования и фемтосекундных время-разрешенных экспериментов. Для определения качества связывания гибридного ДНК-аптамера к нуклеолину in vitro была использована методика поверхностного плазмонного резонанса в сравнении с альбумином. Было показано, что полученные ДНК-переключатели способствуют адсорбции нуклеолина, но не способствуют адсорбции альбумина. В качестве pH-чувствительных фрагментов изначально были исследованы комплексы с «замещающей нитью», однако было показано, что дизайн с pH-зависимыми замещающими нитями, содержащими А-С или A-G мисматчи не обладает необходимыми свойствами. В качестве альтернативы были выполнены исследования по анализу термодинамики систем с и-мотивами в качестве pH-чувствительных фрагментов методами флюоресцентного титрования, плавления и электрофореза, и кинетики методом флюоресценции, а также изучение 8 последовательностей и-мотивов, дизайн которых был выполнен таким образом, чтобы они формировали дуплекс с аптамером к нуклеолину с разной температурой плавления, а также в кислых pH формировали и-мотивы. В результате этих исследований была разработана термодинамическая модель, реализованная в программном коде для анализа данных по кинетике переключения аптамеров и показаны различные режимы функционирования pH-зависимой части. Также взаимодействие нуклеолина с молекулярными переключателями было исследовано методом атомно-силовой микроскопии и электрофореза в сравнении с белком альбумином, которые выявили однозначную pH-зависимость разработанных переключателей при связывании с нуклеолином. Была произведена оценка характера взаимодействия в смеси гибридного ДНК-аптамера и нуклеолина методом динамического светорассеяния с параллельным измерением электрокинетического потенциала при различных pH и соотношением молярных концентраций аптамера к нуклеолину 2:1. Результаты позволили определить качественное распределение по размерам аптамера, нуклеолина и их комплексов. На основании термодинамической модели в RLA режиме агрегации дано аналитическое описание ДРС спектра для водных растворов аптамера, нуклеолина и их комплекса, получены уравнения, связывающие интенсивность рассеянного света в ДРС эксперименте с параметрами агрегации. На основании классической бесконечномерной модели агрегации во фрактальном приближении получено аналитическое выражение для зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического размера коньюгатов фуллерена в методе динамического светорассеяния. Средствами молекулярного моделирования получены сведения об упаковке фуллеренов и их производных в ассоциаты в водных растворах. Было показано, что молекулы производных фуллеренов находятся очень близко друг к другу и вытесняют воду на поверхность. Квантово-химические расчеты для ассоциатов размером до 4 молекул из МД-расчетов выявили значительную эффективность перехода в триплетное состояние, сопоставимую с эффективностью этого процесса в одиночных молекулах, полученную в неводных растворах (толуол). МД-расчеты для оценки влияния конъюгации производных фуллеренов с гибридными аптамерами на свободную энергию связывания с нуклеолином показали, что конъюгация ДНК-аптамера с фуллереном практически не влияет на сродство аптамера к нуклеолину. В экспериментах in vivo в условиях без облучения в видимом диапазоне спектра значения выживаемости при использовании ДНК-аптамера принимали значения от 90 до 100% для всех трех концентраций. В таких же условиях для фуллерена, фуллеренола и аддуктов фуллерена с аминокислотами значения выживаемости также были близки к 100%, что свидетельствует об отсутствии влияния исследованных препаратов на исследованную клеточную линию. С помощью фемтосекундной лазерной абсорбционной спектроскопии на установке ФИЦ ХФ РАН были исследованы фотофизические процессы производных фуллеренов и их конъюгатов с гибридными аптамерами с варьированием упаковки в водных растворах. Для всех центрифугированных образцов (фуллерена, фуллеренола и аддуктов с аминокислотами) имело место увеличение генерации синглетного кислорода по сравнению с нецентрифугированными, причем эффект более выражен при облучении зеленым лазером. Также после центрифугирования размеры кластеров, определенные с помощью динамического светорассеяния, уменьшаются для фуллерена, аддуктов фуллерена с аминокислотами.