Аннотация результатов, полученных в 2024 году
На данной стадии проекта проводились исследования функционирования pH-чувствительного гибридного ДНК-аптамера in vitro относительно белка нуклеолина, влияния компонент конъюгатов ДНК-аптамера с производными фуллерена на выживаемость клеточных линий, а также структурно обусловленные закономерности, обуславливающие фотосенсибилизирующие способности производных фуллеренов С60 в водных растворах средствами компьютерного моделирования и фемтосекундных время-разрешенных экспериментов. Для определения качества связывания гибридного ДНК-аптамера к нуклеолину in vitro была использована методика поверхностного плазмонного резонанса в сравнении с альбумином. Было показано, что полученные ДНК-переключатели способствуют адсорбции нуклеолина, но не способствуют адсорбции альбумина. В качестве pH-чувствительных фрагментов изначально были исследованы комплексы с «замещающей нитью», однако было показано, что дизайн с pH-зависимыми замещающими нитями, содержащими А-С или A-G мисматчи не обладает необходимыми свойствами. В качестве альтернативы были выполнены исследования по анализу термодинамики систем с и-мотивами в качестве pH-чувствительных фрагментов методами флюоресцентного титрования, плавления и электрофореза, и кинетики методом флюоресценции, а также изучение 8 последовательностей и-мотивов, дизайн которых был выполнен таким образом, чтобы они формировали дуплекс с аптамером к нуклеолину с разной температурой плавления, а также в кислых pH формировали и-мотивы. В результате этих исследований была разработана термодинамическая модель, реализованная в программном коде для анализа данных по кинетике переключения аптамеров и показаны различные режимы функционирования pH-зависимой части. Также взаимодействие нуклеолина с молекулярными переключателями было исследовано методом атомно-силовой микроскопии и электрофореза в сравнении с белком альбумином, которые выявили однозначную pH-зависимость разработанных переключателей при связывании с нуклеолином. Была произведена оценка характера взаимодействия в смеси гибридного ДНК-аптамера и нуклеолина методом динамического светорассеяния с параллельным измерением электрокинетического потенциала при различных pH и соотношением молярных концентраций аптамера к нуклеолину 2:1. Результаты позволили определить качественное распределение по размерам аптамера, нуклеолина и их комплексов. На основании термодинамической модели в RLA режиме агрегации дано аналитическое описание ДРС спектра для водных растворов аптамера, нуклеолина и их комплекса, получены уравнения, связывающие интенсивность рассеянного света в ДРС эксперименте с параметрами агрегации. На основании классической бесконечномерной модели агрегации во фрактальном приближении получено аналитическое выражение для зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического размера коньюгатов фуллерена в методе динамического светорассеяния. Средствами молекулярного моделирования получены сведения об упаковке фуллеренов и их производных в ассоциаты в водных растворах. Было показано, что молекулы производных фуллеренов находятся очень близко друг к другу и вытесняют воду на поверхность. Квантово-химические расчеты для ассоциатов размером до 4 молекул из МД-расчетов выявили значительную эффективность перехода в триплетное состояние, сопоставимую с эффективностью этого процесса в одиночных молекулах, полученную в неводных растворах (толуол). МД-расчеты для оценки влияния конъюгации производных фуллеренов с гибридными аптамерами на свободную энергию связывания с нуклеолином показали, что конъюгация ДНК-аптамера с фуллереном практически не влияет на сродство аптамера к нуклеолину. В экспериментах in vivo в условиях без облучения в видимом диапазоне спектра значения выживаемости при использовании ДНК-аптамера принимали значения от 90 до 100% для всех трех концентраций. В таких же условиях для фуллерена, фуллеренола и аддуктов фуллерена с аминокислотами значения выживаемости также были близки к 100%, что свидетельствует об отсутствии влияния исследованных препаратов на исследованную клеточную линию. С помощью фемтосекундной лазерной абсорбционной спектроскопии на установке ФИЦ ХФ РАН были исследованы фотофизические процессы производных фуллеренов и их конъюгатов с гибридными аптамерами с варьированием упаковки в водных растворах. Для всех центрифугированных образцов (фуллерена, фуллеренола и аддуктов с аминокислотами) имело место увеличение генерации синглетного кислорода по сравнению с нецентрифугированными, причем эффект более выражен при облучении зеленым лазером. Также после центрифугирования размеры кластеров, определенные с помощью динамического светорассеяния, уменьшаются для фуллерена, аддуктов фуллерена с аминокислотами.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Была окончательно закончена разработка нового метода анализа нуклеиновых молекулярных переключателей при помощи коротких олигонуклеотидов, имитирующих мишень аптамеров (миметиков). Мы продемонстрировали возможные способы использования коротких нуклеиновых зондов, имитирующих поведение связывания мишени, для изучения термодинамики ДНК-переключателей на основе аптамеров без необходимости применения молекулы-мишени. Предложенная методика позволяет исследовать ДНК-биосенсоры, средства доставки лекарств или биоимиджинговые маячки, управляемые неизвестными, неустойчивыми в лаборатории или дорогостоящими мишенями. Используя миметики, мы выявили pH-зависимые переходы и соответствующие сродства связывания с АТФ трех комплементарных pH-чувствительных вариантов АТФ-аптамера, преодолев ограниченные возможности для данных систем самой молекулы АТФ. Были проделан целый ряд уточняющих экспериментов с системами, разработанными в прошлом году. В частности были методом флюоресцентного титрования определены значения pH при которых происходит переключение (сворачивание нуклеолинового аптамера AS1411 в нативную форму) систем и установлены времена, требующиеся для уравновешивания системы при смене pH. Полученные данные позволили сформулировать и обосновать общий термодинамический подход к дизайну подобных систем, включающих и-мотивы, G-квадруплексы и их не полностью комплементарные дуплексы. Рациональный подход позволил создать pH-переключатели на основе и-мотивов активирующиеся при незначительном закислении физиологических pH с одной стороны и при этом представляющие собой двуцепочечную ДНК в нейтральных и щелочных pH. После всестороннего изучения термодинамики аптамера к нуклеолину, его комплексов с замещающими нитями (и-мотивами) и аптамера к нуклеолину, сшитого с замещающими нитями (и-мотивами), а также классического аптамера к АТФ, был выполнен дизайн и синтез двойного аптамера. В основе принципа его действия лежит абсолютно новая идея управления длиной петли между и-мотивом и G-квадруплексом при помощи внедрения в неё аптамера к АТФ. Ранее нами уже было показано, что снижение длины петли приводит к повышению температуры плавления шпильки нуклеолиновый аптамер — и-мотив, т.е. падает и концентрация G-квадруплекса, способного связывать целевой белок — нуклеолин. При добавлении АТФ происходит стабилизация структуры АТФ аптамера и эффективная длина линкера значительно возрастает, что приводит к высвобождению нуклеолинового аптамера из комплекса с и-мотивов и принятия им функциональной конформации. Влияние pH на систему происходит согласно механизму, детально описанному в отчете прошлого года. А именно, понижение pH провоцирует фолдинг и-мотива, выводя его последовательность из реакции гибридизации с G-насыщенной последовательностью аптамера к нуклеолину. Чтобы проверить способность нового перспективного pH-АТФ-переключателя переходить в нуклеолин-связывающую конформацию была проведена серия титрований по pH и градиенту концентраций АТФ, которая подтвердила успешность дизайна. Для управления трансфекцией препаратов были синтезированы наночастицы серебра диаметром от 5 до 100 нм по светочувствительному протоколу Миркина, а также золотые наночастицы диаметром 5 и 20 нм цитратным методом. Для стабилизации использовался BSPP и PEG-SH (800 Да). Далее 5 и 20 нм наночастицы золота были конъюгированы с и-мотивом TCmm-2, нуклеиновых аптамером AS1411, pH- и pH-АТФ-апатмером. Исследование конъюгации проводилось методом динамического рассеяния света, спектроскопии поглощения и флюоресценции, при помощи АСМ и электрофореза. По результатам исследований 20 нм золотые наночастицы, стабилизированные PEG, были выбраны для проведения исследований на клетках. Исследовано связывание препаратов, содержащих рН и АТФ-рН зависимые аптамеры с флуоресцентными метками Cy5 на клеточных линиях рака шейки матки (Hela) и рака молочной железы (MCF-7). Для рН зависимого аптамера исследовалось связывание при рН 6.0, 6.5, 7.0 и 7.5 (контроль). Для АТФ-рН зависимого аптамера взаимодействие оценивалось при тех же значениях рН и дополнительно в средах с увеличенным (2мМ) содержанием АТФ. Для рН аптамера было установлено, что наибольшее связывание наблюдается при рН 6.5, меньшее по интенсивности флуоресценции – при 7.0 и 7.5. При этом флуоресценция наблюдается преимущественно вблизи ядра и в цитоплазме. Для АТФ-рН зависимого аптамера рН зависимость менее выражена, т.к. интенсивность флуоресценции в средах без АТФ, но с различным рН практически не меняется. При добавлении АТФ в среду интенсивность связывания существенно меняется. Таким образом, интенсивность связывания препаратов, содержащих рН и АТФ-рН зависимые аптамеры, существенно зависит от рН и АТФ, что свидетельствует о чувствительности молекулярных переключателей к этим параметрам в клеточных системах.