Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В рамках второго года проекта были детально исследованы свойства двухфотонного поглощения (TPA) микробного родопсина KR2 и его мутантной формы P219T/S254A, характеризующейся красным смещением спектра однофотонного поглощения. Предварительное молекулярно-динамическое моделирование мутанта выявило два основных конформера мутированного остатка Thr219. Расчеты энергий вертикальных переходов (VEE) методом XMCQDPT2/SA-CASSCF(12,12)/(aug)-cc-pVDZ // EFP подтвердили красное смещение для мутанта на ~0.11-0.13 эВ. Для классического двухфотонного поглощения (CTPA) было установлено, что основной вклад (92-95%) в его сечение вносят так называемые PDP-каналы – пути возбуждения, связанные с постоянными дипольными моментами (ПДМ) основного (S₀) и первого возбужденного (S₁) состояний, а также с дипольным моментом перехода (ДМП) S₀→S₁. Такое доминирование PDP-каналов, обусловленное высокой яркостью перехода S₀→S₁ и значительным перераспределением электронной плотности при возбуждении, подтвердило применимость двухуровневой модели (TLM) для анализа CTPA. Расчетное сечение CTPA для KR2 дикого типа составило ~370 ГМ, а для мутанта P219T/S254A – незначительно больше, ~380 ГМ. Это увеличение объясняется тем, что рост ДМП μ10 у мутанта превалирует над эффектом уменьшения разности ПДМ S₀ и S₁ состояний. Исследование свойств двухфотонного поглощения для изолированной квантовой части ( ~349 ГМ) и изолированного РПШО ( ~1420 ГМ) из мутантных конформеров выявило существенную роль белкового окружения в определении величины CTPA. Для запутанного двухфотонного поглощения (ETPA) также подтверждена применимость TLM и доминирование PDP-каналов. Ключевым результатом стало обнаружение того, что неклассический вклад в ETPA, зависящий от суммы ПДМ S₀ и S₁ состояний и ДМП μ10, на порядок превышает классический вклад. Это приводит к значительному, на порядок, усилению общей вероятности TPA при использовании квантово-запутанных фотонов. Примечательно, что в мутанте P219T/S254A вероятность ETPA снизилась, так как уменьшение суммы ПДМ (ключевого фактора для неклассического вклада) оказалось более значимым, чем увеличение ДМП μ10. Также проведено исследование влияния pH на структурную гетерогенность и фотофизические свойства активного центра родопсина ESR. Установлено, что активный центр ESR существует в виде нескольких конформеров даже при фиксированном значении pH, а изменение pH (через состояние протонирования His57) приводит к появлению дополнительных конформеров. Методом метадинамики и КМ/ММ оптимизации (PBE0/(aug)-cc-pVDZ) для моделей с депротонированным His57 (щелочной pH) идентифицированы конформеры DCF1 (с прямой водородной связью Asp85-РПШО и скрученным ретиналем вокруг связи C13=C14) и DCF2 (без прямой водородной связи Asp85-РПШО, ретиналь более планарный). Для моделей с протонированным His57 (кислый pH) выявлены PCF1 (аналог DCF1, с водородной связью Asp85-His57) и PCF2 (водородная связь Asp85-РПШО, но без водородной связи Asp85-His57). Расчеты энергий вертикальных электронных переходов (VEE) для найденных конформеров (XMCQDPT2/SA-CASSCF // EFP) показали смещение полосы поглощения в длинноволновую область как при удалении водородной связи между аспартатом 85 и протонированным основанием Шиффа ретиналя, так и при протонировании гистидина 57, что связано с уменьшением стабилизации основного состояния вследствие изменения электростатического окружения протонированного основания Шиффа ретиналя. Установлено, что во всем диапазоне pH есть как конформеры, ответственные за образование реакционноспособных возбужденных состояний ESR, так и есть конформеры, ответственные за образование нереакционноспособных возбужденных состояний ESR. На основании детального анализа структурных особенностей каждого конформера и с учетом данных из научной литературы, в частности, о корреляции между строением активного центра и скоростью фотоизомеризации в других родопсинах, была проведена классификация найденных конформеров по реакционной способности. Ключевыми критериями для отнесения конформеров к реакционноспособным служили наличие прямой водородной связи между первичным противоионом аспартатом 85 и протонированным основанием Шиффа ретиналя, а также значительное скручивание полиеновой цепи ретиналя вокруг связи C13=C14. Конформеры, обозначенные в работе как DCF1, PCF1 и PCF2, обладающие такими характеристиками, были отнесены к реакционноспособным, то есть способствующим эффективной фотоизомеризации ретиналя. Напротив, конформеры, такие как DCF2, где прямая водородная связь между аспартатом 85 и протонированным основанием Шиффа ретиналя отсутствовала, а полиеновая цепь ретиналя была более плоской, были классифицированы как нереакционноспособные. Предложена схема, объясняющая экспериментально наблюдаемую pH-зависимость кинетики распада возбужденного состояния родопсина ESR (две компоненты с временами жизни от ~0.5 до ~9 пс). Согласно этой модели, понижение pH от 9.5 до 5.3 приводит к изменению соотношения концентраций между конформерами с депротонированным и протонированным гистидином 57 . При высоких значениях pH доминируют конформеры типа DCF1, обеспечивающий быструю реакционноспособную компоненту, и DCF2, ответственный за нереакционноспособную компоненту. По мере снижения pH и увеличения доли форм с протонированным гистидином 57, таких как PCF1 и PCF2, происходит изменение в кинетике распада возбужденного состояния. В частности, возрастание концентрации реакционноспособного конформера PCF2, который из-за отсутствия водородной связи между гистидином 57 и аспартатом 85 обладает более медленной скоростью фотоизомеризации, а также вероятное появление дополнительного нереакционноспособного конформера, объясняют общее увеличение времен жизни как реакционноспособной компоненты при pH 5.3, так и нереакционноспособной компоненты при pH 5.3. Результаты второго года проекта позволили глубже понять механизмы двухфотонного поглощения в направленно модифицированных родопсинах и выяснить роль pH-индуцированной структурной гетерогенности в фотохимии протонных насосов, что является важным для разработки новых оптогенетических инструментов.