Инструментальный анализ биологических жидкостей с микроэкстракционным выделением антибактериальных лекарственных веществ в супрамолекулярные растворители

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-73-01266

НазваниеИнструментальный анализ биологических жидкостей с микроэкстракционным выделением антибактериальных лекарственных веществ в супрамолекулярные растворители

Руководитель Почивалов Алексей Сергеевич, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет" , г Санкт-Петербург

Конкурс №84 - Конкурс 2023 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах; 03-205 - Аналитическая химия

Ключевые слова Аналитическая химия, микроэкстракция, супрамолекулярные растворители, проточные методы, биологические жидкости, антибактериальные лекарственные вещества, жидкостная хроматография, биофармацевтический анализ, персонализированная медицина.

Код ГРНТИ31.19.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Биофармацевтический анализ имеет важное значение для решения задач персонализированной медицины. Одним из активно развивающихся методов разделения и концентрирования для биофармацевтического анализа является жидкостная микроэкстракция в супрамолекулярные растворители, представляющие собой обогащенные агрегатами амфифилов фазы. Они способны селективно извлекать целевые вещества различной природы, благодаря возможности варьирования свойств экстракционной системы путем выбора подходящего амфифила, а также условий самоорганизации и коацервации. Необходимость расширения возможностей микроэкстракционных методов обуславливает потребность в поиске новых супрамолекулярных систем, а также в накоплении и обобщении экспериментальных данных в этой области для решения аналитических задач, возникающих в медицинских лабораториях. В рамках данного проекта планируется разработать неинвазивные способы биофармацевтического анализа биологических жидкостей с микроэкстракционным выделением антибактериальных лекарственных веществ в супрамолекулярные растворители и дальнейшим их определением с помощью жидкостной хроматографии с подходящими вариантами детектирования. Это позволит повысить производительность биофармацевтического анализа с помощью инструментальных методов, а также снизить трудозатраты, сократить расход проб, реагентов и образующихся отходов. В качестве объектов анализа выбраны моча и слюна, так как их отбор не подразумевает проведение медицинской процедуры, связанной с проникновением через естественные внешние барьеры организма. При реализации проекта будет впервые показана возможность применения соли ди-(2-этилгексил)-фосфорной кислоты в качестве амфифила для получения супрамолекулярного растворителя с целью выделения антибактериальных лекарственных веществ (фторхинолонов) из биологических жидкостей. Данный феномен ляжет в основу метода жидкостной микроэкстракции, который, как предполагается, позволит повысить эффективность экстракции и экспрессность, снизить объемы образующихся отходов. Также, в рамках проекта впервые будет предложен метод on-line жидкостной микроэкстракции антибактериальных лекарственных веществ из биопроб в супрамолекулярный растворитель на основе алкилполиглюкозидов. Данная экстракционная система является перспективной, так как обеспечивает высокую степень извлечения аналита при низких время- и трудозатратах, а также биоразлагаемости амфифила. На основании известных на данный момент свойств таких супрамолекулярных растворителей можно предположить, что извлечение среднеполярных аналитов (фторхинолоны, карбапенемы, тетрациклины) будет эффективным. При этом автоматизированных способов выделения аналитов в супрамолекулярной системе на основе алкилполиглюкозида в литературе не представлено. Эту актуальную задачу планируется решить в данном проекте на принципах проточного анализа.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Почивалов А.С., Гармонов С.Ю., Булатов А.В. Микроэкстракционное концентрирование антибактериальных и нестероидных противовоспалительных лекарственных веществ из жидких и твердых проб Аналитика, том 14, №1, страницы 32-39 (год публикации - 2024)
10.22184/2227-572X.2024.14.1.32.39

2. Шевалев Р.М., Почивалов А.С., Сафонова Е.А., Гармонов С.Ю., Нугбиеньо Л., Булатов А.В. Liquid-phase microextraction approach using supramolecular solvent formed in aqueous systems based on di(2-ethylhexyl)phosphoric acid salt: Spectrophotometric determination of antipyrine in saliva Journal of Molecular Liquids, номер статьи 124986 (год публикации - 2024)
10.1016/j.molliq.2024.124986

3. Лодянов Ю.О., Почивалов А.С., Булатов А.В. Мицеллярная микроэкстракция офлоксацина и моксифлоксацина из мочи для их последующего хроматографического определения Сборник тезисов докладов ХХVII Всероссийской конференции молодых учёных-химиков (с международным участием), с. 397 (год публикации - 2024)

4. Гизатулина З., Почивалов А.С., Нугбиеньо Л., Гармонов С.Ю, Булатов А.В. Cotton disk-assisted liquid–liquid microextraction with solidification of floating organic drop: HPLC-UV determination of enrofloxacin in swabs for cleaning validation in pharmaceutical manufacturing Microchemical Journal , том 203, номер статьи 110927 (год публикации - 2024)
10.1016/j.microc.2024.110927

5. Почивалов А.С., Лодянов Ю.О., Сафонова Е.А., Булатов А.В. Ammonium di(2-ethylhexyl)phosphate-based supramolecular solvent formation: Liquid-phase microextraction of fluoroquinolones from human urine followed by liquid chromatography determination Journal of Molecular Liquids, том 429, номер статьи 127588 (год публикации - 2025)
10.1016/j.molliq.2025.127588

6. Почивалов А.С., Жаворонок М.Ф.И., А. М. Пурвин, Сафонова Е.А., Булатов А.В. Automated liquid-phase microextraction into alkyl polyglucoside-based supramolecular solvent: Determination of tetracyclines in saliva Microchemical Journal , том 213, номер статьи 113617 (год публикации - 2025)
10.1016/j.microc.2025.113617

7. Лодянов Ю.О., Почивалов А.С., Булатов А.В. Microextraction of fluoroquinolones from biological fluids using supramolecular solvents based on di-(2-ethylhexyl)-phosphoric acid salt BOOK OF ABSTRACTS, XIII International Conference on Chemistry for Young Scientists “MENDELEEV 2024”, с. 332 (год публикации - 2024)

8. Жаворонок М.Ф.И., Пурвин А.М., Почивалов А.С., Булатов А.В. Хроматографическое определение тетрациклинов в биологических жидкостях с их предварительным извлечением методом мицеллярной микроэкстракции Материалы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов- 2024», секция «Химия», с. 43 (год публикации - 2024)

9. Почивалов А.С., Булатов А.В. Жидкостная экстракция в супрамолекулярные растворители ХХII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, 7-12 октября, 2024, Федеральная территория «Сириус», Россия. Сборник тезисов докладов в 7 томах, том 2, с. 349 (год публикации - 2024)

10. Лодянов Ю.О., Почивалов А.С., Булатов А.В. Хроматографическое определение офлоксацина и моксифлоксацина в моче с концентрированием аналитов в супрамолекулярный растворитель Тезисы докладов XXXV Российской молодежной научной конференции с международным участием, посвященной 165-летию со дня рождения Н.С. Курнакова, с. 134 (год публикации - 2025)

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В рамках исследований реализован метод on-line микроэкстракционного выделения антибактериальных лекарственных веществ (тетрациклинов) из биологической жидкости (слюна) на принципах циклического инжекционного анализа, предполагающий массоперенос аналитов в супрамолекулярный растворитель на основе алкилполиглюкозидов (АПГ) – экологически безопасных и биоразлагаемых неионогенных поверхностно-активных веществ, получаемых из глюкозы и жирных спиртов. Данные амфифилы были впервые применены в автоматизированном варианте мицеллярной микроэкстракции. В качестве метода анализа была использована высокоэффективная жидкостная хроматография с фотометрическим детектированием (ВЭЖХ-УФ). Проточная система состояла из двух перистальтических насосов, крана-переключателя и смесительной камеры. Сначала в смесительную камеру последовательно подавались проба, раствор АПГ и карбоновая кислота, после чего проводилось перемешивание потоком воздуха. Аналиты солюбилизировались в мицеллы, а высшая карбоновая кислота способствовала укрупнению мицелл и их взаимодействию друг с другом с последующим образованием супрамолекулярного растворителя. Далее выдерживалась пауза до самопроизвольного разделения фаз, и водная фаза направлялась на сброс, а к экстракту разбавляли, перемешивали смесь потоком воздуха и направляли разбавленный экстракт в виалу для хроматографического анализа. Для выделения фазы экстракта в верхней части системы с целью предотвращения образования эмульсии при ее отборе и ускорения фазового разделения без центрифугирования было использовано введение электролита (сульфата натрия) в пробу. Обнаружено, что степени извлечения более гидрофобных аналитов (доксициклин и миноциклин) несколько выше (от 60 до 85 %), чем более полярных (тетрациклин, окситетрациклин), для которых этот параметр варьируется от 45 до 60 %. Это позволило предположить, что гидрофобные взаимодействия между углеводородной цепью амфифила или жирной кислоты и неполярными частями молекул аналитов оказывали положительное влияние на экстрагирующую способность растворителя. Однако, по-видимому, основную роль в процессе связывания аналитов играли индукционные взаимодействия между заряженными молекулами тетрациклинов и полярными областями супрамолекулярных агрегатов, что подтверждалось отсутствием значимых различий в эффективности извлечения в присутствии различных АПГ. Изучение физико-химических свойств супрамолекулярных растворителей показало, что децилглюкозид способствует образованию менее вязкой фазы, в то время как ее плотность почти такая же, как для других. При этом стоит отметить, что данный амфифил обеспечил более высокие значения площади пика для каждого аналита, возможно, из-за меньшего объема экстракта, что определило выбор его как наиболее подходящего амфифила. При 15 % содержании амфифила в его растворе наблюдалась оптимальная гидрофобность супрамолекулярного растворителя, обеспечивающая наилучшую экстрагирующую способность, и высокая прецизионность, поэтому это значение было выбрано в качестве оптимального. В качестве агентов коацервации были изучены пивалевая, гексановая, гептановая, октановая и нонановая кислоты. Исходя из полученных данных можно предположить, что гексановая кислота обладает наиболее оптимальной для данной системы гидрофобностью, что обеспечивает наилучшее извлечение среднеполярных аналитов. Была проведена валидация разработанного способа для определения тетрациклинов в слюне, включающего on-line микроэкстракционное выделение аналитов. Пределы обнаружения составили 10 мкг/л для миноциклина и окситетрациклина, а также 20 мкг/л для тетрациклина и доксициклина. ОСКО в условиях повторяемости варьировалось от 1 до 6 %. Анализ реальных проб слюны показал отсутствие значимого смещения. Установленные аналитические характеристики показали, что предложенный способ позволяет проводить надежное определение аналитов в слюне человека на разных участках фармакокинетической кривой. Разработанный подход позволил заменить токсичные растворители на более безопасные, уменьшить количество используемых реагентов, и достичь более низких пределов обнаружения по сравнению со многими другими процедурами ВЭЖХ-УФ анализа. Кроме того, предлагаемая процедура жидкостно-жидкостной микроэкстракции на основе супрамолекулярного растворителя проводится в автоматизированном режиме с использованием проточной системы, что позволяет повысить воспроизводимость результатов и исключить человеческий фактор в сложной процедуре пробоподготовки в важной области биомедицинских исследований. В данном проекте для микроэкстракционного концентрирования антибиотика фторхинолонового ряда как модельного соединения из водных сред (водного экстракта из тампонов, использованных для пробоотбора с поверхностей оборудования) был разработан способ, включающий кристаллизацию капли экстракта после диспергирования с помощью вращающегося диска для облегчения его отбора. На диск наносили аликвоту расплавленного высшего спирта (н-додеканола). После охлаждения при температуре окружающей среды спирт кристаллизовался на ватном диске. Изготовленный ватный диск помещали в раствор пробы в стеклянном флаконе на магнитной мешалке с нагревом на водяной бане. В процессе нагревания при постоянном перемешивании происходило постепенное диспергирование н-додеканола в водной или водно-органической пробе за счет того, что температура раствора становилась выше температуры его плавления. При этом аналит экстрагировался в фазу экстрагента, а за счет самостоятельного вращения диска благодаря металлической проволоке внутри в пробе образовывался вихрь, который способствовал образованию капли экстракта в его центре. При дальнейшем помещении флакона в ледяную баню происходила кристаллизация капли, которую отбирали с помощью шпателя и растворяли для последующего ВЭЖХ-УФ анализа. Оптимальная температура для экстракции антибиотика составила 65 градусов Цельсия за счёт эффективного диспергирования. Влияние времени вращения диска изучали в интервале от 2 до 12 мин. Было обнаружено, что для установления равновесия системе необходимо 10 мин. Оптимальные объемы пробы и н-додеканола, обеспечивающие наибольшую площадь пика аналита, составили 3 мл и 80 мкл соответственно. По результатам валидации предложенного способа был установлен диапазон определяемых концентраций аналита от 0,6 до 180 мг/л и предел обнаружения равный 0,2 мг/л. Разработанная процедура была применена для проверки полноты очистки фармацевтического оборудования. Пробоотбор проводили смоченными водой тампонами, к которым далее добавляли воду для экстрагирования, а полученные водные экстракты отбирали для проведения микроэкстракции. Предложенный подход может быть далее использован для анализа биологических жидкостей.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Одним из направлений персонализированной медицины является мониторинг лекарственных веществ в биологических жидкостях, который руководствуется данными о связи концентрации лекарственного вещества в биологических жидкостях с его концентрацией в плазме крови и их связи с фармакологическим эффектом препарата. Кроме того, учитывается крайне важная информация о терапевтическом «окне» препарата, то есть диапазон между минимальной эффективной и минимальной токсической концентрациями вещества в плазме. Определение лекарственных веществ в целом и антибактериальных средств в частности (в том числе фторхинолонов и тетрациклинов) в биологических жидкостях может быть полезно для учета индивидуальной вариабельности фармакокинетических параметров при проведении антимикробной терапии с целью подбора режимов дозирования, обеспечивающих оптимальную эффективность и безопасность для конкретного человека. В рамках работы над проектом разработаны микроэкстракционные, в том числе автоматизированные, способы проведения пробоподготовки биологических жидкостей, которые могут найти применение в биофармацевтическом анализе в медицинских лабораториях. Проведенные исследования продемонстрировали высокую экстрагирующую способность супрамолекулярных растворителей по отношению к различным лекарственным веществам, что показывает потенциал замены классических растворителей с помощью данных экстрагентов. Предложенные экстракционные системы могут быть использованы в дальнейшем для выделения различных классов лекарственных веществ, не только тех, что были выбраны для настоящего исследования.