Аннотация результатов, полученных в 2024 году
1. Получены экзосомы из клеточных линий колоректального рака человека HT29 и HCT116, из плазмы крови пациентов больных колоректальным раком на 4 стадии заболевания до и после лечения, и от здоровых добровольцев. Проведено измерение основных физико-химических параметров экзосом (гидродинамический диаметр, концентрация, концентрация белка). Получены изображения экзосом методом просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения и проведен анализ морфологии и размера везикул. Проведено исследование мембранных маркеров экзосом методами вестерн-блоттинга и дот-блоттинга. Анализ полученных данных позволил определить экспрессию характерных экзосомальных маркеров семейства тетраспанинов CD63, CD9 и маркера эпителиального фактора роста EpCAM, сверэкспрессиия которого характерна также и для опухолевых тканей. Выявлена экспрессия уникального мембранного маркера CPNE3 в экзосомах, полученных из плазмы крови пациентов до терапевтического лечения. При этом экспрессия данного маркер отсутствовала в экзосомах, выделенных из плазмы крови пациентов, которые получали терапевтическое лечение. Установлено общее снижение концентрации экзосом в образцах для пациентов после лечения по сравнению с образцами экзосом пациентов до лечения, и как следствие снижение экспрессии маркера CD63 в образцах экзосом для пациентов после лечения. Проведено измерение образцов экзосом клеточных линий, пациентов до и после лечения, и здоровых добровольцев методом масс-спектрометрии. Проведен анализ полученных данных, который после фильтрации данных выявил 875 экзосомальных белков во всех измеренных образцах. Установлено, что 22 белка являются уникальными и встречаются только в образцах экзосом, полученных от пациентов до терапевтического лечения, при этом 16 из них идентифицируются как везикулярные. Количественное определение белков по параметру iBAQ (intensity Based Absolute Quantification) выявило наличие белков крови, которые участвуют в поддержании гемостаза и иммунного ответа. 2. Проведено исследование взаимодействия экзосом, выделенных из клеточной линии колоректального рака человека HCT116, с магнитными микросферами, содержащих молекулы дубильной кислоты на поверхности. Получены данные о концентрации везикул и белка в надосадочной жидкости (супернатанте), на основании которых установлено, что эффективность связывания экзосом с поверхностью магнитных микросфер, содержащих молекулы дубильной кислоты, составляет порядка от 50 до 60% в зависимости от типа полиэлектролитной оболочки на микросферах. Наибольшую эффективность связывания порядка 60% показали микросферы, оболочка которых была сформирована из дубильной кислоты в паре с бычьим сывороточным альбумином или полиалиламиногидрохлорида. Найдено, что отсоединение экзосом с поверхности магнитных микросфер с эффективностью более 50% может быть выполнено путем инкубации образцов в 0,1% Tween-20. Измерения ядерного-магнитного резонанса и масс-спектрометрии комплексов дубильной кислоты/фосфатидилхолина и дубильной кислоты/бычьего сывороточного альбумина позволили предсказать возможный механизм взаимодействия молекул дубильной кислоты с экзосомами. Практическое применение разработанного подхода было протестировано на выделении экзосом из супернатанта клеточной линии колоректального рака человека HCT116. Эффективность выделения с применением магнитных микросфер оказалась сопоставима с эффективностью выделения экзосом методом эксклюзионной хроматографии, при этом время, затрачиваемое на выделение везикул с помощью магнитных микросфер, оказалось в 2 раза ниже. 3. Отработана методика окрашивания экзосом липофильным флуоресцентным красителем, для задач регистрации экзосом флуоресцентными методами исследования. Окрашенные экзосомы были применены для исследования взаимодействия экзосом, находящимися в модельном растворе плазмы крови с магнитными микросферами, содержащими молекулы дубильной кислоты на поверхности. Было исследовано влияние количества циклов инкубации экзосом с магнитными микросферами и количества магнитных микросфер, добавляемых к экзосомам на связывание везикул с магнитными микросферами. Выявлено связывание компонентов плазмы крови (бычий сывороточный альбумин) с магнитными микросферами и крайне низкий характер взаимодействия экзосом с молекулами дубильной кислоты на поверхности магнитных микросфер. Установлено, что применение магнитных микросфер, содержащих молекулы дубильной кислоту на поверхности малоэффективно для захвата экзосом, находящихся в плазме крови. 4. Доработана и оптимизирована технология функционализации магнитных наносфер аптамерами, специфичных к мембранным белкам экзосом. Были определены: 1) оптимальная концентрация стрептавидина (0,1 мг) при реакции биоконъюгации с магнитными наносферами (1 мг); 2) оптимальная концентрация биотинулированного аптамера (75 нМ) для связывания с магнитными наносферами, функционализированных стрептавидином; 3) оптимальное количество магнитных наносфер со стрептавидином (0,4 мг) для эффективной конъюгации с биотинулированным аптамером. Найденные параметры были использованы для получения конъюгата магнитных наносфер со стрептавидином и биотинилированного аптамера анти-EpCAM. Установлено, что магнитные наносферы, покрытые стрептавидином, образуют устойчивый комплекс с биотинилированным анти-EpCAM аптамером и эффективно захватывают экзосомы из культуральной среды клеток рака кишечника HT29. Проведена количественная оценка экзосом, окрашенных липофильным красителем, с помощью метода флуоресцентной проточной цитометрии. Показано успешное определение окрашенных EpCAM-положительных экзосом в диапазоне концентраций 107-109 везикул/мл. 5. Во второй год выполнения проекта по результатам проведенных работ была опубликована 1 публикация (с учетом квартиля 2 публикации) в изданиях, индексируемых Web of Sciense или Scopus. Подготовлена публикация и отправлена в редакцию журнала «Трансляционная медицина», тематический номер журнала «Внеклеточные везикулы: большие перспективы маленьких объектов» (получено положительное решение о принятие публикации к печати, РИНЦ). По достигнутым результатам исследования подана заявка на регистрацию РИД (“Способ выделения экзосом из биологических жидкостей с помощью частиц, модифицированных дубильной кислотой”, патент на изобретение, 07.11.2024, W24074151, 2024133371) 6. Информация о проекте размещена в сети Интернет: https://rscf.ru/news/release/magnitnye-chastitsy-s-dubilnoy-kislotoy-uprostyat-diagnostiku-raka-na-rannikh-stadiyakh/ https://faculty.skoltech.ru/people/alexeyyashchenok http://biophotonicsskoltech.ru/#projects https://nauka.tass.ru/nauka/21242983 https://digital.gov.ru/ru/events/51751/ https://www.1tv.ru/publikacii/obzor-smi/v-rossii-sozdali-magnitnye-mikrochasticy-dlya-bystrogo-vyyavleniya-opuholey

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Проведено физико-химическое и молекулярное исследование внеклеточных везикул (экзосом), циркулирующих в плазме крови пациентов с заболеванием колоректальным раком в зависимости от стадии заболевания и от места забора биожидкости. Обнаружено различие в физико-химических параметрах экзосом в группах пациентов. Обнаружено, что количество экзосом и содержание белка в группе пациентов с заболеванием 2 и 3 стадии ниже по сравнению с группой пациентов с заболеванием 4 стадии и с группой здоровых добровольцев. Для всех образцов характерно наличие посторонних примесей в виде липопротеинов и белков плазмы в образцах. Маркеры CD9 и CD63, относящиеся к семейству тетраспанинов, детектируются во всех образцах, что подтверждает экзосомальную природу выделенных везикул. Анализ образцов экзосом методом масс-спектрометрии показал присутствие типичных маркеров экзосом. Количество идентифицированных белков было сопоставимо внутри и между группами, но ниже в образцах крови забранной около опухоли. Анализ генных онтологий показывает обогащенность образцов внеклеточных везикул, полученных из плазмы крови, белками, характерными для следующих клеточных и субклеточных компонент: белки внеклеточного пространства, внеклеточные везикулы, экзосомы, микровезикулы крови, секреторные гранулы, внеклеточный матрикс. Попарный анализ LFQ-интенсивностей белков внеклеточных везикул выявил выраженные и направленные различия протеомных профилей между клиническими группами. В перитуморальных образцах наблюдается повышение уровней белков, ассоциированных с ремоделированием внеклеточного матрикса и клеточной миграцией, а также воспалительных медиаторов, что отражает активное опухолевое микроокружение и локальный воспалительный ответ. Отработана и оптимизирована методика выделения экзосом с помощью магнитных сфер из клеточных линий и из плазмы крови пациентов с заболеванием колоректальным раком. Установлено, что число захваченных экзосом на магнитных сферах, покрытых анти-CD63 или анти-EpCAM аптамером растет, как при увеличении количества магнитных сфер, так и при увеличении времени инкубации. Оптимальный захвата экзосом происходит в буфере PBS. Определено соотношение числа экзосом к количеству магнитных сфер, покрытых дубильной кислотой для захвата максимального числа экзосом. Установлено, что экзосомы на поверхности магнитных сфер не разрушаются и имеют характерную границу фосфолипидного бислоя. Получены данные о мембранных маркерах CD63 и EpCAM экзосом на магнитных сферах, покрытых дубильной кислотой (неспецифический захват экзосом) методом проточной цитофлуориметрии. Установлено, что уровень экспрессии белков в экзосомах зависит от источника выделения экзосом и в целом коррелирует с данными экспрессии белков, наблюдаемые методом вестерн-блоттинга. Результаты показали, что данная методика позволяет эффективно проводить определение характеристического экзосомального маркера CD63 и онкомаркера EpCAM экзосом, обогащенных из кондиционированной среды культур клеток HT29 и SKBR3 магнитными сферами без предварительного выделения методом эксклюзионной хроматографии. Молекулярное профилирование мембранных белков экзосом на поверхности магнитных микросфер, покрытых специфическими аптамерами, показало зависимость уровня сигнала флуоресценции от количества используемых микросфер, времени и температуры инкубации. Оптимальные условия для максимального сигнала были достигнуты при концентрации микросфер 50 мкг, длительном времени инкубации и пониженной температуре, что обеспечивало эффективное взаимодействие между аптамером анти-CD63 и мембранами экзосом и минимальное неспецифическое связывание. Установленный предел детекции мембранного белка EpCAM на уровне ~ 107 свидетельствует о чувствительности метода, позволяя обнаруживать достаточно низкие концентрации экзосом в образцах. Полученные результаты подтверждают перспективность использования аптамер-модифицированных магнитных микросфер для анализа и диагностики биомаркеров, ассоциированных с экзосомами. Проведено предварительное выделения экзосом магнитными сферами, покрытых антителом (специфический захват) и покрытых дубильной кислотой (неспецифический захват) из плазмы крови пациентов с заболеванием колоректальным раком 4 стадии до и после лечения без предварительной очистки методом эксклюзионной хроматографии. Проведен анализ экзосом на магнитных сферах на уровень экспрессии онкомаркеров HER2 и EpCAM характерного экзосомального маркера CD63 методом проточной цитофлуориметрии. Результаты показали, высокое неспецифическое взаимодействие при использовании флуоресцентных аптамеров в качестве детекторов экзосомальных маркеров для обоих типов магнитных сфер. Вместе с тем, при использовании в качестве детектора флуоресцентного антитела целевой сигнал также был крайне низким, вне зависимости от типа магнитных сфер. Проведено исследование о возможности высвобождения захваченных экзосом магнитными сферами, покрытых дубильной кислотой (неспецифическое связывание). Найдено, что эффективность высвобождения экзосом с магнитных сфер максимально при использовании буфера TRIS (pH 10), в то время как эффективность высвобождения оказалось низкой при использовании ацетатного буфера и водного раствора 2M NaCl. Разработаны композитные носители на основе микросфер ватерита (CaCO3) с включением углеродных точек (CDs) и наночастиц магнетита (MNPs) в структуру микросферы. Изучены фотолюминесцентные (ФЛ) свойства композитов в зависимости от архитектуры углеродных точек, наночастиц магнетита и полиэлектролитных слоев в структуре носителей. Определена оптимальная структура композитов, для которых получен высокий квантовый выход ФЛ. Установлено влияние архитектуры композитов на интенсивность ФЛ при измерениях методом проточной цитометрии. ФЛ в композитах может быть возбуждена лазером на длине волны 405, 488 и 638 нм, что демонстрирует их потенциальное применение для многоканальных измерений. Полученные композитные носители демонстрируют низкую токсичность in vivo. 5. По результатам проведенных работ были опубликованы три статьи (с учетом квартиля 5 публикаций) в изданиях, индексируемых Web of Sciense или Scopus. В отчетном периоде возникли исключительные права на результаты интеллектуальной деятельности, созданные при выполнении проекта: “ Способ выделения экзосом из биологических жидкостей с помощью частиц, модифицированных дубильной кислотой”, патент на изобретение, № 2845376, дата регистрации 18.08.2025, № заявки 2024133371 от 07.11.2024. 6. Информация о проекте размещена в сети Интернет: https://biophotonicsskoltech.ru/#projects https://www.skoltech.ru/en/news/tannic-acid-coated-magnetic-beads-will-facilitate-early-cancer-diagnosis