Влияние вязкоупругих свойств и липидно-белкового профиля опухолевых клеток на их миграционную активность

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-74-00045

НазваниеВлияние вязкоупругих свойств и липидно-белкового профиля опухолевых клеток на их миграционную активность

Руководитель Игнатова Надежда Ивановна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации , Нижегородская обл

Конкурс №79 - Конкурс 2023 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-204 - Биофизика

Ключевые слова Плазматическая мембрана, раковая клетка, микровязкость, вязкоупругость, молекулярные роторы, микроскопия времени жизни флуоресценции FLIM, времяпролетная масс-спектрометрия вторичных ионов ToF-SIMS, колебательная микроспектроскопия BCARS, FTIR, атомно-силовая микроскопия АСМ.

Код ГРНТИ34.17.23, 76.03.29

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Миграция опухолевых клеток, лежащая в основе инвазии и метастазирования, является неотъемлемой составляющей опухолевой прогрессии. Большая часть исследований в этой области сфокусирована на изучении цитоскелета и мембранных белков, тогда как роль физического состояния мембраны и клеточная механика мало изучены. В проекте предлагается использовать современные высокочувствительные безметочные (label-free) методы химического картирования: масс-спектрометрию вторичных ионов и колебательную микроспектроскопию для оценки липидного состава мембран клеток и для выявления особенностей локализации липидно-белковых компонент клетки в процессе миграции с разрешением до 100-200 нм. Визуализация локальной вязкости на субклеточном уровне в реальном времени в живых клетках будет проводиться методом флуоресцентной время-разрешенной микроскопии FLIM с флуоресцентными молекулярными роторами. Также будет использована атомно-силовая микроскопия (АСМ) как уже зарекомендовавший себя метод исследования вязкоупругих свойств клеток, опосредованных цитоскелетом. Проект направлен на выполнение следующих задач: 1) Анализ липидно-белкового состава, микровязкости и вязкоупругих свойств опухолевых клеток с разной миграционной способностью. Сравнение опухолевых и нормальных клеток для установления базовых физико-химических особенностей, миграционно-активных клеток. 2) Оценка особенностей липидно-белкового состава, микровязкости и вязкоупругих свойств опухолевых клеток при индукции эпителиально-мезенхимального перехода для выявления изменений, связанных с миграцией. 3) Химическое картирование липидного состава плазматической мембраны в латеральной плоскости, картирование микровязкости и вязкоупругих характеристик при моделировании клеточной миграции в одном направлении с помощью теста на «зарастание раны» для выявления особенностей, связанных с движением клеток. 4) Оценка изменений микровязкости, вязкоупругих свойств опухолевых клеток и их химического профиля при фармакологическом ингибировании и стимуляции миграции различными агентами. 5) Измерение микровязкости, вязкоупругих свойств и химического состава мембран клеток в составе многоклеточных структур - 3D опухолевых сфероидов для установления базовых изменений, связанных с инвазией и взаимодействием клеток с внеклеточным матриксом. В проекте впервые будет предпринята попытка соотнесения профилей вязкости нормальных и опухолевых клеток на субклеточном уровне, измеренной с помощью FLIM, с механическими свойствами, измеренными с помощью АСМ, и липидно-белковым составом клеток. Впервые будут оценены изменения в микровязкости, вязкоупругих свойствах и химическом составе мембран опухолевых клеток in vitro в процессе эпителиально-мезенхимального перехода, при стимуляции и ингибировании клеточной миграции, в том числе в многоклеточных структурах. Таких комплексных исследований в области биофизики клетки ранее не проводилось. Детальное исследование биофизических и химических аспектов клеточной миграции имеет важное значение для понимания фундаментальных механизмов миграции при опухолевой прогрессии и разработки новых методов терапии, направленных на предотвращение диссеминации опухолевых клеток.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Ефремов Ю.М., Шимолина Л., Гулин А., Игнатова Н., Губина М., Куимова М.К., Тимашев П.С., Ширманова М.В. Correlation of Plasma Membrane Microviscosity and Cell Stiffness Revealed via Fluorescence-Lifetime Imaging and Atomic Force Microscopy Cells, 12, 2583 (год публикации - 2023)
10.3390/cells12212583

2. Шимолина Л., Игнатова Н., Дружкова И., Куимова М., Ширманова М. Changes in plasma membrane microviscosity of human colorectal cancer cells with different migration activity Book of abstact "17th International conference on Laser Applications in Life Sciences", p. 50 (год публикации - 2023)

3. Шимолина Л.Е. Применение FLIM микроскопии с молекулярным ротором BODIPY2 для анализа микровязкости цитоплазматических мембран опухолевых клеток Сборник трудов Всеросиийской конференции, с. 52 (год публикации - 2023)

4. Пряжникова М.И., Игнатова Н.И., Дружкова И.Н. Влияние метаболитов E. coli различных штаммов на клетки колоректального рака Материалы XXVI Международной медико-биологической конференции молодых исследователей, с. 244-245 (год публикации - 2023)

5. Игнатова Н.И., Пряжникова М.И., Дружкова И.Н., Ширманова М.В. Влияние микробиома человека на миграционную активность на миграционную активность клеток колоректального рака Вопросы онкологии, №3, Т.69, С.12. (год публикации - 2023)

6. Пряжникова М.И., Игнатова Н.И., Дружкова И.Н. Влияние метаболитов различных штаммов E. coli на пролиферативную активность клеток колоректального рака Тезисы докладов "76-я Международная школа-конференция молодых ученых «Биосистемы: организация, поведение, управление»", с 263 (год публикации - 2023)

7. Шимолина Л.Е., Хлынова А.Е., Дружкова И.Н., Игнатова Н.И., Загайнова Е.В., Куимова М.К. , Ширманова М.В. The role of microviscosity of the cytoplasmic membrane of tumor cells during chemotherapy Biophysical Reviews, 15, 1832–1833 (год публикации - 2023)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Целью проекта является исследование биофизических механизмов миграции раковых клеток, в частности - установление особенностей вязкостных и вязкоупругих свойств клеток и их липидно-белкового профиля, связанных с клеточной подвижностью и канцерогенезом, с помощью методов флуоресцентной-время-разрешенной микроскопии, атомно-силовой микроскопии, масс-спектрометрии, колебательной микроспектроскопии. Второй год проекта был направлен на получение данных о микровязкости, химическом профиле и вязкоупругих свойств мембран нормальных и опухолевых клеток, а также об изменениях микровязкости и механических свойств опухолевых клеток при моделировании «зарастания раны» и индукции эпителиально-мезенхимального перехода. Во второй год проекта были получены следующие основные научные результаты: - Изучены особенности микровязкости мембран и их липидного профиля и вязкоупругих свойств опухолевых и нормальных клеток. Методом FLIM-микроскопии с флуоресцентным молекулярным ротором BODIPY2 обнаружено, что клетки рака молочной железы MCF-7 обладают более вязкими мембранами по сравнению с нормальными клетками эпителия молочной железы MCF-10A. Значения микровязкости составили 483±66 сП и 304±56 сП, соответственно (р= 0.00001). Методом ToF-SIMS получены данные об особенностях липидного состава мембран нормальных клеток и выполнено сопоставление с профилем опухолевых клеток. Показано, что клетки MCF-10A демонстрируют повышение сигнала холестерина, сфингомиелина и и полиненасыщенных жирных кислот и снижение сигнала фосфатидилхолина по сравнению с мембранами опухолевых клеток. Методом АСМ обнаружено, что клетки MCF-7 были существенно выше, в то время как MCF-10A были более распластаны по поверхности. Клетки MCF-7 имели существенно более низкую жесткость, чем клетки MCF-10A. Два вязкоупругих параметра, E0 и η, также были существенно меньше для клеток MCF-7. - Выполнено комплексное исследование микровязкости и химического состава мембран опухолевых клеток, а также вязкоупругих свойств целых клеток при индукции ЭМП. Обнаружено, что в результате индукции ЭМП микровязкость мембран клеток колоректального рака человека HT29 возрастает, а модуль Юнга снижается к 7-му дню индукции ЭМП. По данным ToF-SIMS в опухолевых клетках с индуцированным ЭМП сигналы сфингомиелина и фосфатидилхолина снижались на 15 и 50%, соответственно, сигнал холестерина повышался на 20%, а доля ненасыщенных жирных кислот возрастала относительно контроля. Приобретение эпителиальными клетками мезенхимального фенотипа сопровождалось изменением морфологии клеток и уровня экспрессии стандартных маркеров ЭМП (виментин и Е-кадгерина). - Изучены изменения микровязкости и вязкоупругих свойств опухолевых клеток при «зарастании раны» в клеточной культуре. Получены карты распределения микровязкости в популяции опухолевых клеток при активации движения в сторону дефекта клеточного монослоя с помощью FLIM-микроскопии, демонстрирующие снижение микровязкости цитоплазматической мембраны в связи с миграцией. Для клеток с разной миграционной способностью НТ29 и SW480 характерны схожие изменения микровязкости мембран. Так, для клеток НТ29 в монослое значение микровязкости составило 432 ± 39 сП, на краю раны - 406 ± 51 сП, в мигрирующих группах клеток в ране - 276 ± 40 сП. Для клеток SW480 зарегистрирована микровязкость 481 ± 73 сП для плотного монослоя клеток, 367 ± 45 сП для приграничных клеток, 292 ± 39 сП для мигрирующих клеток. Методом АСМ показано, что клетки SW480 на границе, а также внутри раны, имеют меньшую жесткость, чем клетки в монослое. При этом клетки в области раны были мягче, чем клетки на границе. Для линии HT29 не наблюдалось значимых отличий во всех измеренных методом АСМ параметрах между клетками в монослое и на границе раны. Высота клеток HT29 в обоих случаях была больше, чем у клеток SW480 во всех измеренных состояниях, а эффективный модуль Юнга ниже. Таким образом, все поставленные на второй год задачи выполнены полностью. Результаты отвечают требованиям новизны и оригинальности и соответствуют мировому уровню. В результате реализации второго этапа проекта опубликована 1 статья в журнале Proc. SPIE (WoS, Scopus), 1 статья находится на рецензии в журнале Cell Cycle (WoS, Scopus, Q1). С учетом перевыполнения показателей первого года проекта, общие обязательства по публикациям на момент предоставления отчета участники проекта считают выполненными. Сделано 6 докладов на конференциях разного уровня, опубликовано 2 тезиса в материалах международных конференций, 3 тезисов в материалах Всероссийских конференций.

Публикации

1. Пряжникова М.И, Игнатова Н.И. Изменение миграционной активности различных культур клеток колоректального рака под воздействием метаболитов кишечной палочки Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2024», с. 1 (год публикации - 2024)

2. Шимолина Л.Е., Ефремов Ю.М., Игнатова Н.И., Гулин А.А., Дружкова И.Н., Щеславский В.И., Куимова М.К., Тимашев П.С., Ширманова М.В. Viscoelastic properties of human colorectal cancer cells with different migration activity Proceedings of SPIE, Vol. 13010, 1301008 (год публикации - 2024)
10.1117/12.3026232

3. Метлина В.А., Л. Е. Шимолина, М. K. Куимова, А. М. Можеров, М. В. Ширманова Микровязкость мембран клеток колоректального рака человека при разной миграционной активности БИОСИСТЕМЫ: ОРГАНИЗАЦИЯ, ПОВЕДЕНИЕ, УПРАВЛЕНИЕ. Тезисы докладов 77-й Международной школы-конференции молодых ученых. , с. 233 (год публикации - 2024)

4. Метлина В.А., Шимолина Л.Е., Куимова М.K., Можеров А.М., Ширманова М.В. Анализ микровязкости мембран клеток колоректального рака человека с разной миграционной активностью методом FLIM с флуоресцентным молекулярным ротором Сборник тезисов Х Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «ВолгаМед» , c. 60-62 (год публикации - 2024)

5. Пряжникова М.И., Игнатова Н.И., Дружкова И.Н. Изменение адгезивной активности клеток колоректального рака под влиянием метаболитов кишечной палочки Сборник тезисов Х Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «ВолгаМед» (год публикации - 2024)

6. Пряжникова М.И., Игнатова Н.И., Дружкова И.Н. Исследование состава метаболитов кишечной палочки и их влияния на миграционную активность клеток колоректального рака ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА И КЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА - ЧЕЛОВЕК И ЕГО ЗДОРОВЬЕ Материалы XXVII Международной медико-биологической конференции молодых исследователей., с. 296-297 (год публикации - 2024)

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Целью проекта является исследование биофизических механизмов миграции раковых клеток, в частности - установление особенностей вязкостных и вязкоупругих свойств клеток и их липидно-белкового профиля, связанных с клеточной подвижностью и канцерогенезом, с помощью методов флуоресцентной время-разрешенной микроскопии, атомно-силовой микроскопии, масс-спектрометрии, колебательной микроспектроскопии. Третий год проекта был направлен на анализ и интерпретацию данных о химическом составе нормальных и опухолевых клеток с различной миграционной способностью статистическими и хемометрическими методами, на получение данных о микровязкости и химическом профиле мембран и вязкоупругих свойств опухолевых клеток при фармакологическом воздействии на миграционную активность. В третий год проекта были получены следующие основные результаты: - При моделировании клеточной миграции с помощью теста на «зарастание раны» было выполнено химическое картирование липидного состава мембран опухолевых клеток и их липидно-белкового профиля. Было обнаружено, что в мембранах клеток SW480 на 3-ий день миграции в «рану» значительно повышается сигнал фосфатидилхолина (на 27%, p < 0.001) , что согласуется со снижением микровязкости мембран. В мембранах клеток НТ29 на 3-ий день обнаружено снижение сигналов фосфатидилэтаноламина (на 15%, p < 0.001) и фосфатидилхолина (на 40%, p < 0.001) и повышение сигнала фасфаинозитола (на 22%, p < 0.001), которые вносят вклад в снижение микровязкости мембран; на 7-ой день обнаружено снижение сигналов фенилаланина (на 39%, p < 0.001) и лецитина (на 42%, p < 0.001), что обуславливает повышение микровязкости мембран, показанное на предыдущем этапе проекта. - Были проанализированы данные о химическом составе клеток с различной миграционной способностью статистическими и хемометрическими методами. Показаны значительные различия в химическом составе мембран клеток колоректального рака человека с различной миграционной способностью, а также нормальных эпителиальных клеток и клеток рака молочной железы. Обнаружено, что в миграционный потенциал опухолевых клеток вклад вносят упругие свойства цитоскелета и повышенная микровязкость мембраны. Было выполнено сравнение данных о химическом составе мембран с данными о микровязкости и упругости опухолевых клеток. Обнаружено, что при неопластической трансформации наблюдается разобщение связи между упругостью и микровязкостью – опухолевые клетки в отличие от нормальных имеют меньшую упругость и более вязкую мембрану. При неопластической трансформации ремоделирование липидного состава мембраны играет важную роль в поддержании более высокой микровязкости мембраны и обеспечении структурной целостности клетки. - Отработаны методики фармакологического воздействия на миграционную активность опухолевых клеток на клеточных культурах. Обнаружены морфологические изменения при воздействии ингибирующих и активирующих миграцию агентов. Показано, что цитохалазины B и D вызывают снижение скорости зарастания «раны», в то время как добавление эпидермального фактора роста EGF её увеличивает по сравнению с контролем без воздействия. - Выполнено исследование вязкостных изменений мембран опухолевых клеток при фармакологическом действии цитохалазинов B и D на миграционную активность с помощью молекулярного ротора BODIPY2 и время-разрешенной микроскопии FLIM. Показано, что цитохалазины вызывают быстрое и стабильное снижение микровязкости мембран клеток SW480 с 386 сП до ~300 сП (p < 0,005). В клетках НТ29 снижение микровязкости мембран с 372 сП до ~340 сП (p < 0,005) при действии цитохалазинов было отсроченным. - Выполнена оценка вязкоупругих свойств опухолевых клеток при воздействии цитохалазинами B и D, ингибирующими миграционную активность, с использованием атомно-силовой микроскопии. Было показано, что при воздействии цитохалазинами B и D) снижается эффективная жесткость клеток, как более инвазивной линии SW480, так и линии HT29 со слабым миграционным потенциалом. Обнаружено, что в клетках SW480 после воздействия цитохалазином D наблюдалось существенное (на 48%, p < 0.0001) снижение жесткости клеток (эффективного модуля Юнга), а при действии цитохалазина B падение эффективного модуля Юнга составило лишь 20% (p < 0.005). При воздействии цитохалазином D на клетки HT29 падение эффективного модуля Юнга составило 45% (p < 0.0001), а при действии цитохалазина B модуль Юнга практически не изменился. Было зарегистрировано изменение вязкоупругих параметров (снижение модуля E1, ньютоновской вязкости η, и рост показателя степени α) при действии цитохалазинов B и D для обеих клеточных линий. - Выполнена оценка липидного состава мембран опухолевых клеток с использованием метода время-пролетной масс-спектрометрии ToF-SIMS при ингибировании миграционной активности цитохалазинами B и D. Оценен сигнал основных классов липидов и жирных кислот с разной длиной цепей и степенью насыщенности. Несмотря на некоторые различия в уровне сигнала различных липидов, статистически значимых различий до и после воздействия для линий клеток SW480 и HT29 не наблюдалось. Зарегистрировано незначительное снижение доли мононенасыщенных жирных кислот для обеих клеточных линий, на 17 8% и 8% соответственно, при действии цитохалазина В. С использованием метода спектроскопии комбинационного рассеяния были зарегистрированы различия в спектрах для клеток SW480 и HT29 без фармакологической модификации. Значительных различий между контрольными клетками SW480 и клетками после инкубации с цитохалазинами D и B не обнаружено. Обнаружено повышение сигнала в области 1380 см-1 и в области валентных колебаний C=O 1650–1850 см⁻¹ при действии цитохалазина D на клетки HT29. Таким образом, все поставленные на третий год задачи выполнены полностью. Результаты отвечают требованиям новизны и оригинальности и соответствуют мировому уровню. В результате реализации третьего этапа проекта приняты к публикации 3 статьи в журналах Scientific Reports (WoS, Scopus, Q1), Archives of Razi Institute (WoS, Scopus, Q2) и Cell Cycle (WoS, Scopus, Q1). Сделано 9 докладов на конференциях разного уровня, опубликовано 4 тезиса в материалах международных конференций, 2 тезиса в материалах Всероссийских конференций.

Публикации

1. Хлынова А.Э., Шимолина Л.Е., Игнатова Н.И., Ефремов Ю.М., Куимова М.К., Ширманова М.В. Взаимосвязь миграционной активности опухолевых клеток с микровязкостью мембран клеток колоректального рака человека Сборник тезисов конференции Биосистемы: организация, поведение, управление : Тезисы докладов 78-й Всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых, Нижний Новгород, 14–18 апреля 2025 года, С. 265 (год публикации - 2025)

2. Хлынова А.Э., Шимолина Л.Е., Игнатова Н.И., Ефремов Ю.М., Куимова М.К., Ширманова М.В. Оценка микровязкости мембран клеток колоректального рака человека в зависимости от миграционной активности с использованием микроскопии flim и молекулярного ротора BODIPY2 Сборник тезисов XI Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «ВолгаМед» (Нижний Новгород, 19–21 марта 2025 г.) : сборник тезисов конференции , с. 72-74 (год публикации - 2025)

3. Хлынова А.Э., Ширманова М.В. Вязкость мембран опухолевых клеток: корреляция с миграционными характеристиками Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2025» / Отв. ред. И.А. Алешковский, А.В. Андриянов, Е.А. Антипов, Е.И. Зимакова. [Электронный ресурс], - (год публикации - 2025)

4. Хлынова А.Э., Шимолина Л.Е., Игнатова Н.И., Дружкова И.Н., Куимова М.К., Ширманова М.В. Оценка микровязкости мембран клеток колоректального рака, отличающихся миграционной активностью, с использованием FLIM микроскопии и молекулярного ротора BODIPY2 Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ-2025: материалы XX международной научной конференции, Севастополь, 2025. , с. 125-126 (год публикации - 2025)

5. Шимолина Л., Хлынова А., Игнатова Н., Дружкова И., Гулин А., Елагин В., Шерин П., Куимова М., Ширманова М. Unraveling biophysics of tumor cells: imaging of membrane microviscosity using FLIM with molecular rotors Abstracts of the international conference “Advanced Laser Technologies”, p. 104 (год публикации - 2025)

6. Шимолина Л.Е., Хлынова А.Е., Гулин А.А., Куимова М.К., Ширманова М.В. Fluorescence lifetime imaging microscopy FLIM with BODIPY2 molecular rotor used to measure cancer cell membrane microviscosity Abstracts of the 21st Congress of the European Society for Photobiology, August 24 – 28 2025, Bari, Italy, p. 156 (год публикации - 2025)

7. Шимолина Л., Ефремов Ю.М., Хлынова А., Игнатова Н., Айбуш А., Куимова М.К., Тимашев П.С., Ширманова М. Dynamic Changes in Cellular Mechanics and Membrane Microviscosity During Migration of Colorectal Cancer Cells Cell Cycle (год публикации - 2026)

8. Шимолина Л., Ефремов Ю.М., Гулин А., Игнатова Н., Айбуш А., Куимова М.К., Тимашев П.С., Ширманова М. Comparison of viscoelastic properties of breast cancer and normal cells using AFM, FLIM and ToF-SIMS techniques Scientific Reports (год публикации - 2025)
10.1038/s41598-025-31162-3

9. Игнатова Н., Пряжникова М., Селиверстов А., Абидуллина А., Гамаюнов С., Ширманова М., Дружкова И. Effects of Tumor-Associated E. coli Metabolites on Migration of Colorectal Cancer Cells Archives of Razi Institute (год публикации - 2025)
10.22092/ARI.2025.368270.3499