Изменение активности ферментативных систем антиоксидантной защиты при старении и ревитализации мезенхимных стволовых клеток человека

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-74-01142

НазваниеИзменение активности ферментативных систем антиоксидантной защиты при старении и ревитализации мезенхимных стволовых клеток человека

Руководитель Иванова Юлия Сергеевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук , г Санкт-Петербург

Конкурс №84 - Конкурс 2023 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова активные формы кислорода, редокс-гомеостаз, антиоксидантная защита, тиол-дисульфидный обмен, перекись водорода, биосенсор HyPer, репрограммирование, ревитализация, мезенхимные стволовые клетки

Код ГРНТИ34.15.49

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Старение – процесс функциональной деградации органов и тканей организма, ассоциированный с возрастом. Среди существующих теорий старения одной из самых известных является свободнорадикальная теория, предложенная в 1956 г. Д. Харманом. В качестве основной причины старения эта теория определяет накопление с течением жизни окислительных повреждений ДНК, белков и липидов, вызванное действием свободных радикалов и других представителей семейства активных форм кислорода (АФК), образующихся в клетках по действием факторов окружающей среды и/или в ходе внутриклеточных метаболических процессов. Однако, предлагаемые в рамках свободнорадикальных теорий односторонние подходы предотвращения старения – попытки снизить уровень АФК в организме путем применения экзогенных антиоксидантов или усилить собственные системы антиоксидантной защиты клеток за счет оверэкспрессии отдельных ее элементов – не привели пока к положительным результатам в экспериментах на млекопитающих. Современные представления о старении предполагают, что окислительные повреждения макромолекул клетки являются важной, но далеко не единственной составляющей общего возраст-ассоциированного износа, который рассматривается в настоящее время в качестве основного триггера старческой деградации всех систем организма. Таким образом, вопросы об особенностях внутриклеточного редокс-гомеостаза и причинах его изменения с возрастом, об истинных причинно-следственных связях между старением и деградацией редокс-систем клеток является сложным и многофакторным – для их разрешения требуются системные подходы и новые экспериментальные методики. Необходимо разработать методы, позволяющие характеризовать редокс-системы клетки не только на транскрипционном/трансляционном уровне, ограничиваясь определением уровня и активности белков – отдельных компонентов этих систем – в клеточных лизатах, но позволяющие проводить функциональные тесты на эффективность редокс-систем в живых клетках. В данном проекте предлагается использовать недавно разработанную в нашей лаборатории, но уже успешно апробированную методику, позволяющую использовать генетически-кодируемый биосенсор перекиси водорода HyPer для количественного определения различных характеристик редокс-систем клетки прижизненно. Мы предлагаем использовать эту методику для оценки эффективности систем антиоксидантной защиты в цитоплазме постаревших мезенхимных стволовых клетках (МСК) человека. С помощью HyPer в молодых и состаренных МСК планируется оценить пероксидазную активность, количественно определяя уровень Н2О2, устанавливающийся в цитоплазме клеток в условиях внешнего окислительного стресса, а также охарактеризовать тиол-восстанавливающую активность клеток, измеряя скорость восстановления тиоловых групп HyPer внутриклеточными дисульфидредуктазами после отмены окислительной нагрузки. Кроме того, использование модуляторов этих систем позволит нам выяснить, какие из антиоксидантных ферментативных систем и в какой степени контролируют редокс-гомеостаз в молодых и состаренных МСК при различных окислительных нагрузках, а также выяснить, возможно ли восстановить функционал систем антиоксидантной защиты МСК, утраченный или ослабленный в результате клеточного старения. Более того, помимо молодых и состаренных клеток, эффективность систем антиоксидантной защиты предполагается проанализировать при обращении клеточного старения вспять – в ревитализованных клетках, полученных с использованием методики частичного репрограммирования, основанной на кратковременной активации 4 факторов плюрипотентности Яманаки. Таким образом, решение задач проекта позволит провести масштабный скрининг функциональной активности антиоксидантных и тиол-восстанавливающих систем МСК человека в процессе развития клеточного старения и ревитализации.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Люблинская О.Г., Иванова Ю.С. Генетически кодируемый биосенсор HyPer как инструмент для количественного определения внутриклеточного уровня перекиси водорода Цитология, Том 66, №3 (год публикации - 2024)

2. Иванова Ю.И., Шорохова М.А., Пуговкина Н.А., Кожухарова И.В., Алексеенко Л.Л., Гурьев Н.А., Кунеев И.К., Домнина А.П., Гринчук Т.М., Земелько В.И., Люблинская О.Г. Partial reprogramming exerts a rejuvenating effect on human mesenchymal stem cells that underwent replicative senescence in culture International Journal of Molecular Sciences, MDPI, Basel, 25(23), 12533 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms252312533

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Окислительный стресс и те окислительные повреждения макромолекул, которые он вызывает, на протяжении долгого времени считался одним из ключевых индукторов клеточной сенесценции. Согласно существующей гипотезе, способность сенесцентных клеток противостоять окислительному стрессу снижена, однако полученные данные зачастую противоречивы и основаны на экспериментах, проведенных на транскрипционном/трансляционном уровне или в клеточных лизатах, что в конечном итоге не характеризует функциональную активность антиоксидантных систем живых клеток, направленных на детоксификацию внутриклеточных окислителей. В рамках исследований, проведенных в 2024-2025 году, нами была использована разработанная в рабочем коллективе участников данного проекта проточно-цитометрическая методика, основанная на генетически кодируемом биосенсоре HyPer и позволяющая характеризовать пероксидазную активность в молодых и сенесцентных мезенхимных стволовых клетках (МСК) в условиях внешнего H2O2-индуцированного окислительного стресса, причем количественным параметром оценки в данной методике является определяемая внутриклеточная молярная концентрация перекиси водорода. Основные результаты работы показали, что внутриклеточные концентрации перекиси водорода в молодых и сенесцентных МСК изменяются от единиц до сотен наномолей в условиях внешнего нецитотоксического Н2О2-индуцированного окислительного стресса (10 до 100 мкМ H2O2). При этом пероксидазная активность клеток демонстрирует двухфазную динамику: при слабом окислительном стрессе (10–40 мкМ) она максимальна, но снижается по мере увеличения окислительной нагрузки; при умеренных концентрациях экзогенной Н2О2 (40–100 мкМ) сохраняет постоянный уровень. Парадоксальным результатом стало обнаружение повышенной по сравнению с молодыми клетками пероксидазной активности в сенесцентных МСК, что идет вразрез с распространенной гипотезой об ослаблении антиоксидантной защиты при развитии клеточного старения. Дальнейшие эксперименты, проведенные с помощью ингибиторного анализа и подхода по нокдауну целевых генов, показал, что тиоредоксин-зависимые пероксидазы вносят вклад в обеспечение пероксидазной активности только при слабом окислительном стрессе, тогда как глутатион-зависимые пероксидазы вносят вклад в детоксификацию перекиси водорода при всех тестируемых окислительных нагрузках. Ревитализация сенесцентных МСК с использованием приема частичного репрограммирования (кратковременной оверэкспрессии факторов Яманаки) не привела к восстановлению пероксидазной активности до уровня молодых клеток. В рамках настоящего этапа выполнения проекта мы также провели поиск потенциальных мишеней для фармакологических препаратов, воздействие на которые сможет изменить функциональную антиоксидантную активность в МСК таким образом, чтобы она была схожа с наблюдаемой молодых клетках. Было обнаружено, что селенит натрия, стимулирующий фермент тиоредоксинредуктазу, способствует усилению дисульфидредуктазной активности МСК, сниженной при активации программ сенесценции. Таким образом, исследования, проведенные в 2023/2024 году, позволили провести комплексный анализ функциональной активности пероксидазной системы МСК человека в процессе развития клеточной сенесценции создали научно-технический задел для разработки стратегий для коррекции ассоциированных с сенесценцией нарушений редокс-гомеостаза.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта обладают высокой прикладной значимостью и могут быть использованы в экономике и социальной сфере в нескольких направлениях. В первую очередь, разработанные методики прижизненной количественной оценки функциональной активности антиоксидантных систем клеток человека на основе генетически кодируемого сенсора HyPer представляют собой инновационный аналитический инструмент, имеющий потенциал для применения в биомедицинских исследованиях, клеточной терапии, фармакологическом скрининге и контроле качества клеточных продуктов. В рамках проекта также сформирован научный задел в области редокс-биологии, направленный на глубокое понимание механизмов клеточного старения и поиска мишеней для его обращения. Полученные данные могут лечь в основу разработки новых лекарственных средств и терапевтических стратегий. Кроме того, показанная в проекте возможность частичного репрограммирования как метода восстановления функциональности стареющих клеток может стать основой для создания биотехнологических решений в сфере клеточного «омоложения» и использовано в разработке технологий продления активного долголетия, что имеет прямую социальную значимость.