Анализ деградации амилоидных фибрилл под действием ферментов иммунной системы для увеличения эффективности и безопасности антиамилоидной терапии

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-74-10092

НазваниеАнализ деградации амилоидных фибрилл под действием ферментов иммунной системы для увеличения эффективности и безопасности антиамилоидной терапии

Руководитель Сулацкая Анна Игоревна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук , г Санкт-Петербург

Конкурс №85 - Конкурс 2023 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые слова Амилоидозы, нейродегенеративные заболевания, антиамилоидная иммунотерапия, стабильность и деградация амилоидных фибрилл, цитотоксический эффект, протеолитические ферменты, флуоресцентные зонды

Код ГРНТИ34.17.15

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Накопление упорядоченных белковых агрегатов, амилоидных фибрилл, вызывает широкий спектр амилоидозов (таких как AL-, AA- и гемодиализный амилоидозы), а также сопутствует различным нейродегенеративным заболеваниям (таким как болезни Альцгеймера и Паркинсона), что приводит к нарушению функционирования жизненно важных органов. До недавнего времени антиамилоидных лекарственных средств зарегистрировано не было, но за последние 2 года Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) было одобрено 2 препарата для лечения болезни Альцгеймера, представляющих из себя специфичные к фибриллярному бета-амилоидному пептиду моноклональные антитела, направленные на активизацию иммунного ответа и деградацию амилоидных агрегатов на ранних стадиях заболевания. Однако влияние этих препаратов на когнитивные функции оказалось неоднозначным и сопровождалось значительными побочными эффектами (в том числе, амилоид-ассоциированными отеками, мозговыми кровотечениями, аутоиммунным менингоэнцефалитом и эффузией). Мы полагаем, что существенные недостатки одобренных лекарственных средств могут быть обусловлены накоплением токсичных амилоидных изоформ, формирующихся в результате иммунного ответа на тканевом уровне. В связи с этим данный проект будет направлен на исследование механизмов деградации амилоидных бляшек после воздействия таких антиамилоидных препаратов, а также анализ структуры, свойств и цитотоксичности формирующихся при этом продуктов деградации амилоидов. В частности, в ходе выполнения проекта планируется: 1) проанализировать универсальность предложенной антиамилоидной терапии путем исследования механизмов и эффективности индивидуального и совокупного воздействия ферментов, вырабатывающихся клетками иммунной системы (таких как внутриклеточные катепсины B и D, а также внеклеточная матриксная металлопротеиназа-9), на амилоиды, формирующиеся не только при болезни Альцгеймера, но и при других заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона, гемодиализный, инсулиновый и лизоцимовый амилоидозы; 2) сделать предположение о причинах побочных эффектов антиамилоидной терапии на основании анализа структуры и свойств продуктов деградации амилоидов, формирующихся после воздействия протеолитических ферментов, и токсичности различных белковых изоформ для широкого спектра иммортализованных и первичных клеточных линий различного происхождения (таких как HeLa, глиобластома, нейробластома, дермальные фибробласты, мезенхимные стромальные клетки); 3) установить, существует ли связь между причиной развития амилоидоза или стадией заболевания и антиамилоидным эффектом протеолитических ферментов путем сравнения воздействия клеточных факторов на амилоидные фибриллы и их кластеры на основе одного белка, сформированные при различных условиях фибриллогенеза или имеющие различную степень «зрелости»; 4) проанализировать влияние густонаселенной среды клетки на деградацию амилоидов под действием различных факторов на основании данных об этом процессе, полученных в условиях макромолекулярного краудинга; 5) исследовать воздействие амилоидов и продуктов их деградации на клетки иммунной системы in vitro; 6) исследовать распространение амилоидов и продуктов их деградации in vivo их локальном введении грызунам; 7) проанализировать возможные пути увеличения эффективности деградации амилоидов и снижения патогенности продуктов их деградации. Проведение запланированных исследований позволит сделать предположение о причинах неоднозначной эффективности антиамилоидных препаратов на основе моноклональных антител и возникновения амилоид-ассоциированных побочных эффектов после их применения, о возможном влиянии этих лекарственных средств на амилоидные агрегаты, формирующиеся на различных стадиях болезни Альцгеймера и системных амилоидозов, и предложить методы усовершенствования разработанной антиамилоидной терапии.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Сулацкий М.И., Степаненко О.В., Степаненко О.В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Сулацкая А.И. Prediction of the feasibility of using the ≪gold standard≫ thioflavin T to detect amyloid fibril in acidic media. Analytical Chemistry, том 96, № 5, стр. 2158-2164 (год публикации - 2024)
10.1021/acs.analchem.3c05118

2. Сулацкий М.И., Степаненко О.В., Степаненко О.В., Поварова О.И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Сулацкая А.И. Broken but not beaten: Challenge of reducing the amyloids pathogenicity by degradation. Journal of Advanced Research, Volume 70, Pages 45-62 (год публикации - 2024)
10.1016/j.jare.2024.04.018

3. Невзглядова О.В., Михайлова Е.В., Сойдла Т.Р. Амилоиды. Эволюционное прошлое и биотехнологическое будущее. Цитология, Nevzglyadova O. V., Mikhailova E. V., Soidla T. R. Amyloids. Evolutionary Past and Biotechnological Future. Cell and Tissue Biology, 2024, Vol. 18, No. 6. P. 587-601. На первом этапе проекта в отчете (в мае 2024 г) была представлена статья, принятая к публикации в журнале «Цитология» (справка о принятии приложена к отчету). Публикации в этом журнале до мая 2024 г. автоматически дублировалась в переводной версии в журнале «Cell and Tissue Biology». Однако после принятия статьи в журнал «Цитология» и завершения отчетного периода по грату из-за реорганизации платформы, на которой публикуется журнал «Cell and Tissue Biology» (см. объявление на официальном сайте журнала http://tsitologiya.incras.ru/), перед авторами был поставлен выбор – опубликовать принятую статью только в журнале «Цитология» или только журнале «Cell and Tissue biology». Авторами было принято решение в пользу журнала «Cell and Tissue Biology» по причине его более высоких показателей и более ранних сроков публикации. Таким образом, отчетная публикация в журнале "Цитология" была опубликована в виде переводной версии в журнале «Cell and Tissue biology» (ISSN 1990-5203, Scopus, "Белый список", CiteScore 0.8, Q4). (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.1134/S1990519X24700512

4. Сулацкий М.И., Степаненко Ольга В., Степаненко Олеся В., Михайлова Е.В., Сулацкая А.И. From protective enzyme to facilitator of amyloid propagation: Cathepsin D-mediated amyloid fibril fragmentation International journal of biological macromolecules, Volume 304, Part 2, 140971 (год публикации - 2025)
10.1016/j.ijbiomac.2025.140971

5. Сулацкий М.И., Степаненко Олеся В., Степаненко Ольга В., Сулацкая А.И. Amyloid degradation mechanisms and potential synergistic effects Neural regeneration research, Volume 21 (год публикации - 2026)
10.4103/NRR.NRR-D-24-01534

6. Сулацкий М.И., Степаненко Олеся В., Степаненко Ольга В., Михайлова Е.В., Сулацкая А.И. Cathepsin B prevents cell death by fragmentation and destruction of pathological amyloid fibrils CELL DEATH DISCOVERY, Volume 11, 61 (год публикации - 2025)
10.1038/s41420-025-02343-w

7. Степаненко Ольга В., Сулацкий М.И., Михайлова Е.В., Степаненко Олеся В., Сулацкая А.И. Degradation of pathogenic amyloids induced by matrix metalloproteinase-9 International Journal of Biological Macromolecules, Volume 281, Part 3, 136362 (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.136362

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Проведено сравнение влияния трех протеолитических ферментов, участвующих в иммунном ответе (цистеиновой протеазы катепсина В (CTSB), аспартатной протеазы катепсина D (CTSD) и матриксной металлопротеиназы-9 (MMP9)), на амилоидные фибриллы 1) сразу после их подготовки и через несколько месяцев инкубирования при физиологической температуре, 2) в разбавленных буферных растворах и в условиях макромолекулярного краудинга, 3) при одиночном и совместном действии ферментов. Объектами исследования стали амилоиды на основе Абета-пептида, альфа-синуклеина и лизоцима, фибриллогенез которых сопутствует болезням Альцгеймера, Паркинсона и лизоцимовому амилоидозу, соответственно. 1) В результате проведенных исследований показано, что амилоидные фибриллы лизоцима, сформированные в различных условиях и имеющие различные размеры, структуру и склонность к кластеризации, подвергаются фрагментации под действием CTSB и CTSD и деструктурированию под действием MMP9. Таким образом, на примере модельных амилоидов установлено, что условия, инициирующие фибриллогенез, не влияют на механизм деградации амилоидов под действием ферментов клеток иммунной системы. При этом оказалось, что структура и степень кластеризации амилоидов на основе одного и того же белка влияет на эффективность их разрушения, а также на цитотоксичность продуктов деградации амилоидов после воздействия протеолитических ферментов. Таким образом, антиамилоидный эффект ферментов иммунной системы (и других факторов со сходными механизмами воздействия) может зависеть не только от типа амилоидов (амилоидогенного белка), но и от условий их формирования. Результаты исследований, проведенных на амилоидах лизоцима с полиморфной структурой, также впервые позволили показать, что происходит с этими белковыми агрегатами при их длительном инкубировании при физиологической температуре. За 11 месяцев наблюдения выявлено уменьшение размеров крупных амилоидных кластеров, их разделение на отдельные амилоидные волокна, фрагментация и укорочение этих волокон, деполимеризация фибрилл на мономерные субъединицы, уменьшение содержания в них упорядоченной бета-складчатой структуры, а также существенное снижение токсичности амилоидов для клеток Hek-293, HeLa TK-, SK-N-MC и DF1. Таким образом, нами впервые была доказана способность амилоидов «стареть». Анализ воздействия лизосомальных протеаз CTSB, CTSD и MMP9 на свежеприготовленные и «зрелые» (проинкубированные в течение 11 месяцев) амилоиды показал, что механизм деградации фибрилл различной степени «зрелости» идентичен, однако эффективность их разрушения со временем возрастает. 2) На примере амилоидов альфа-синуклеина с использованием методик, позволяющих проводить исследования в вязких средах, показано, что присутствие в пробе краудинг-агентов разной химической природы с разными молекулярными весами (полиэтиленгликоля и декстрана), имитирующих густонаселенную среду клетки, влияет на деградацию амилоидов под действием ферментов иммунной системы. В частности, показано, что присутствие краудинг-агентов способно значительно снижать эффективность фрагментации амилоидных фибрилл под действием CTSD, ингибировать разупорядочивание фибриллярной структуры амилоидов под действием CTSВ и в значительной степени или полностью ингибировать (в зависимости от краудинг-агента) как фрагментацию, так и разупорядочивание этих фибрилл после воздействия ММР9. Оказалось, что цитотоксичность продуктов протеолитической деградации амилоидов альфа-синуклеина в условиях макромолекулярного краудинга может превышать цитотоксичность продуктов деградации этих фибрилл в разбавленном водном растворе. На основании полученных результатов сделано заключение о возможном влиянии густонаселенной среды клетки на механизмы, эффективность и скорость разрушения амилоидов под действием ферментов иммунной системы (и других деградирующих факторов) за счет эффекта исключенного объема. 3) Проведен масштабный анализ, позволивший выявить три основных механизма деградации амилоидов: деструктурирование без уменьшения размеров агрегатов, фрагментация с сохранением фибриллярной структуры и деполимеризация до мономеров. Установлены недостатки каждого из них: мономеризация не препятствует реполимеризации и не эффективна для фибриллярных кластеров, деструктурирование зачастую повышает цитотоксичность бляшек, а фрагментация может ускорять фибриллогенез и распространение амилоидов. На основании результатов проведенного анализа сделано заключение о низкой эффективности и высокой вероятности побочных эффектов однокомпонентных антиамилоидных препаратов. Для увеличения эффективности деградации амилоидов предложен комбинированный подход, основанный на объединении амилоид-деградирующих факторов с различными механизмами действия. Для проверки применимости предложенного подхода проанализировано последовательное воздействие на амилоиды на основе лизоцима, альфа-синуклеина и абета-пептида фермента MMP9, преимущественно вызывающего разупорядочивание фибриллярной структуры, и фермента CTSВ, преимущественно приводящего к фрагментации фибрилл. Анализ изменения размеров, вторичной и третичной структуры амилоидов после последовательного добавления выбранных ферментов позволил сделать заключение об увеличении эффективности деградации фибрилл при совместном воздействии этих протеаз по сравнению с их одиночным воздействием. В частности, установлено заметное уменьшение размера отдельных фибрилл и фибриллярных кластеров, что является важным шагом к полному разрушению амилоидов. Кроме того, для всех типов фибрилл доказано существенное снижение упорядоченности структуры амилоидного волокна при совместном воздействии ферментов, что ингибирует способность продуктов деградации выступать в качестве затравок фибриллогенеза, а, значит, предотвращает реполимеризацию амилоидов после прекращения деградирующего воздействия. Однако, при выбранной последовательности воздействия ферментов не выявлено увеличения содержания мономерных и олигомерных субъединиц в пробах, снижения устойчивости продуктов деградации к ионным детергентам и к кипячению, а также снижения цитотоксичности проб по сравнению с результатами, наблюдаемыми при одиночном воздействии протеаз. Таким образом, полученные результаты показали, что последовательное воздействие ферментов, приводящих сначала к разупорядочиванию, а затем к уменьшению размеров амилоидов, хотя и не приводит к снижению цитотоксичности агрегатов, но способствует повышению эффективности деградации амилоидных фибрилл и может предотвращать их реполимеризацию. Это свидетельствует о перспективности предложенного нами комбинированного подхода и необходимости варьирования условий эксперимента для дальнейшего увеличения эффективности деградации и снижения цитотоксичности амилоидов, что станет задачей следующего этапа проекта.

Публикации