Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В рамках второго года выполнения Проекта были выполнены обе поставленные на отчетный период задачи: 1. Подтверждена гипотеза о роли дерегуляции NADPH-оксидазы в окислении рианодиновых рецепторов и последующем накоплении ионов миоплазматического кальция, снижении силы сокращений и росте утомляемости камбаловидных мышц крыс Вистар в условиях 7-суточного вывешивания; 2. Проверена гипотеза о ключевой роли снижения содержания альфа-кетоглутарата в волокнах камбаловидной мышцы крыс в повышении CpG-метилирования промоторов генов, реализующих окислительный, «медленный» фенотип волокон, и снижении уровня их экспрессии после 7-суточного вывешивания. Для проверки первой гипотезы было проведено два эксперимента: В рамках первого из них самцы крыс линии Вистар возрастом 2 месяца и массой 170–200 граммов были случайным образом разделены на 3 группы по 16 животных в каждой: 1. С – виварный контроль с ежедневным внутрибрюшинным введением плацебо (физраствор); 2. 7HS – 7-суточное вывешивание с ежедневным внутрибрюшинным введением плацебо (физраствор); 3. 7HSL – 7-суточное вывешивание с ежедневным внутрибрюшинным введением 40 мг/кг лозартана (непрямой ингибитор NOX2). После проведения эксперимента в камбаловидных мышцах животных было оценено относительно содержание ионов кальция в миоплазме и в митохондриях, был оценен индекс утомления и максимальная сила сокращений изолированных мышц, оценена площадь поперечного сечения мышечных волокон, а также проведен анализ содержания митохондриальной ДНК и экспрессия мРНК генов-регуляторов биогенеза митохондрий и оценена доля окисленного тропомиозина в экспериментальных образцах. В рамках второго эксперимента животные того же веса и возраста были случайным образом разделены на 3 группы по 8 животных в каждой: 1. С – виварный контроль; 2. 7HS – 7-суточное вывешивание; 3. 7HSS – 7-суточное вывешивание с ежедневной дозой 50 мг/кг S-107 (препарат поступал с кормом) После проведения эксперимента в камбаловидных мышцах животных было оценено относительно содержание ионов кальция в миоплазме и в митохондриях. По итогам анализа экспериментальных данных было выяснено, что что введение лозартана способствует снижению уровня окислительного стресса в тканях камбаловидных мышц вывешенных животных, а также частично предотвращает рост относительного содержания ионов миоплазматического и митохондриального кальция. Следует отметить, что последние два эффекта совпадают с эффектами применения блокатора окисления рианодиновых рецепторов S-107 на фоне вывешивания. Не исключено, что лозартан мог воздействовать на содержание ионов миоплазматического и митохондриального кальция путем предотвращения окисления рианодиновых рецепторов. Это подтверждает гипотезу, проверка которой была намечена на второй год выполнения Проекта. Применение лозартана также приводит к предотвращению роста мышечной утомляемости и падения силы камбаловидных мышц, и предотвращает атрофию мышечных волокон. Эти эффекты совпадают с эффектами S-107, оцененными в первый год выполнения Проекта; не исключено что они также имеют в основе механизм, связанный с предотвращением накопления избытка миоплазматического кальция, способствуя предотвращению активации кальций-зависимых протеолитических процессов, вызывающих нарушение электро-механического сопряжения. Для проверки второй гипотезы животные того же веса и возраста были случайным образом разделены на 3 группы по 8 животных в каждой: 1. C – виварный контроль с ежедневным внутрибрюшинным введением плацебо (физраствор); 2. 7HS – 7-суточное вывешивание с ежедневным внутрибрюшинным введением плацебо (физраствор); 3. 7HS+D2K – 7-суточное вывешивание с ежедневным внутрибрюшинным введением 200 мг/кг диметил-2-кетоглутарата. Из камбаловидных мышц выделили тотальную РНК, ДНК, а также белковую фракцию, и проанализировали методом иммуногистохимического анализа ППС волокон «быстрого» и «медленного» типов на поперечных криосрезах. ДНК была подвергнута бисульфитной конверсии, после чего методом ПЦР специфичной к CpG-метилированию были проанализировано содержание полностью метилированных участков промоторов генов-регуляторов типа мышечного волокна и биогенеза митохондрий. Также был проанализирован уровень фосфорилирования АМФ-активируемой протеинкиназы, ключевого регулятора биогенеза митохондрий в скелетных мышцах. По итогам анализа экспериментальных данных было обнаружено, что введение диметил-2-кетоглутарата вывешенным животным частично предотвращает снижение экспрессии мРНК регуляторов биогенеза митохондрий и содержание митохондриальной ДНК, а также снижает уровень CpG-метилирование ряда генов, однако за исключением гена нейрональной NO-синтазы, в группе 7HS не происходит достоверного роста уровня метилирования промоторов указанных генов, а снижение уровня метилирования промоторных участков исследованных генов в группе 7HS+D2K не сопровождается предотвращением снижения экспрессии их мРНК-продуктов. Также в группе 7HS+D2K было обнаружено увеличение уровня фосфорилирования АМПК, что, вероятнее всего, и объясняет эффект введения D2K на экспрессию мРНК регуляторов биогенеза митохондрий и содержание митохондриальной ДНК на фоне вывешивания задних конечностей крыс.