Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Создание удвоенных гаплоидов позволяет значительно сократить сроки селекции моркови. Если спонтанное удвоение генома у гаплоидов не происходит, требуется применение методов удвоения генома с помощью антимитотических агентов, что осложняется отсутствием эффективных протоколов. Мы оценивали токсичность и эффективность колхицина и трифлуралина для искусственного удвоения хромосомного набора моркови с целью создания наиболее оптимальной методики удвоения генома моркови столовой. Мы протестировали обработку моркови антимитотическими агентами на стадии эмбрионов, что было выполнено впервые. Интенсивный вторичный эмбриогенез эмбрионов моркови позволил обработать и проанализировать большое число генетически идентичных эмбрионов, а именно 30 штук и более на каждую концентрацию антимитотика. При оценке токсичности антимитотических препаратов было показано, что 0,01 – 1 г/л колхицин не нарушает регенерацию растений моркови. Трифлуралин также не оказывал токсического действия при концентрациях 0,001 – 0,01 г/л. При этом 0,1 г/л трифлуралин снижал выживаемость в среднем на 40% и замедлял регенерацию проростков, а 1 г/л трифлуралин вызывал быструю гибель всех эмбрионов. Оценка плоидности с помощью проточной цитометрии показала, что без обработки не происходит удвоения ДНК в гаплоидных контрольных образцах на стадии эмбрионов и при регенерации в растения. 0,01 - 1 г/л колхицин и 0,001 - 0,1 г/л трифлуралин могут удваивать геном моркови. Самый высокий процент диплоидов обнаруживался после воздействия 1 г/л колхицина (34%) и 0,1 г/л трифлуралина (28%). Самый высокий процент диплоидов вместе с частичными диплоидами (миксоплоидами) наблюдался при обработке 0,01 и 0,1 г/л трифлуралином (более 70%) и 1 г/л колхицином (56%). При повышении концентрации антимитотических агентов снижалось число гаплоидных растений, и возрастало количество тетраплоидов и октоплоидов. Насколько нам известно, трифлуралин тестировался впервые для удвоения генома у растений моркови. Растения-регенеранты, сформировавшиеся из обработанных антимитотиками эмбрионов, высаживались в торф спустя 3-4 месяца после обработки, где успешно адаптировались к условиям ex vitro. Использование добавок при обработке эмбрионов, таких как 0,3% Tween 20 и 0,025% гибберелиновой кислоты (GA3), улучшало регенерацию растений, но снижало эффективность удвоения. При обработке 0.01 и 0.1 г/л трифлуралином с добавлением Tween 20 и GA3 регенерировало 0% диплоидов и 24 и 53% частичных диплоидов (миксоплоидов), соответственно. Растения, регенерировавшие из обработанных 1 г/л колхицином с добавлением Tween 20 и GA3 эмбрионов, были диплоидами в 0% случаев, частичные диплоиды (миксоплоиды) наблюдались в 37% случаев. Использование 2% или 4% ДМСО совместно с антимитотическими агентами приводило к гибели эмбрионов. Предобработка эмбрионов 3 мМ гидроксикарбамидом в течение 18 часов с целью синхронизации клеток в клеточном цикле с последующей обработкой антимитотическими агентами также приводила к гибели эмбрионов. Проводились обработки антимитотиками на других стадиях развития, начиная от микроспор до растений в условиях ex vitro. Обработка микроспор 0,01 г/л колхицином и 0,01 г/л трифлуралином в первые 48 часов после выделения оказывала токсическое действие, подавляя их деление и дальнейшее развитие в эмбрионы. Обработка растений-регенерантов in vitro показала, что при обработке 0.01 г/л и 0.1 г/л трифлуралином наблюдается 14% и 9% диплоидов, соответственно. При этом образуется 85% и 63% диплоидов вместе с частичными диплоидами (миксоплоидами). Обработка 1 г/л колхицином приводит к 20% диплоидов и 60% диплоидов в сумме с частичными диплоидами (миксоплоидами). Адаптация растений к условиям ex vitro была успешна только при долгой культивации in vitro (3–4 месяца) после обработки антимитотическими агентами. Обработка произрастающих ex vitro растений колхицином в концентрации 1 г/л показала, что происходит частичное повреждение листьев обработанных растений. При этом образуются миксоплоиды в 80% случаев. При этом диплоиды не были обнаружены. Данные исследования показали, что удвоение генома можно проводить на стадии эмбрионов, а также растений in vitro и ex vitro. При этом лучшей стадией развития для обработки являются эмбрионы, так как малый размер эмбрионов позволяет проводить обработки большого числа эмбрионов в небольших объемах с минимальным количеством реагентов и с высокой эффективностью. Все запланированные работы по гранту были выполнены, и была напечатана статья (https://www.mdpi.com/2311-7524/11/5/505).