КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер проекта 23-76-10013

НазваниеРоль факторов транскрипции и генов протекторных белков в формировании устойчивости к абиотическим стрессам в растениях винограда

Руководитель Хватков Павел Алексеевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Ордена Трудового Красного Знамени Никитский ботанический сад - Национальный научный центр РАН" , Республика Крым

Конкурс №85 - Конкурс 2023 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-104 - Агробиотехнологии

Ключевые слова Биоинженерия, виноград, засоление, засухоустойчивость, редактирование генома

Код ГРНТИ62.37.29


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Vitis vinifera L. - важная экономическая плодовая культура в мире. На рост винограда часто влияют факторы окружающей среды, такие как засуха, засоление, холод, болезни и вредители, которые серьезно снижают урожайность и качество винограда, и ограничивают развитие виноградной отрасли. Целью исследований по этому проекту будет изучение функциональной роли новых генов, регуляторных элементов и физиолог-биохимических механизмов для повышения продуктивности и устойчивости винограда к основным общемировым абиотическим стрессовым факторам внешней среды (холодостойкость, морозоустойчивость, зимостойкость, засухоустойчивость и устойчивость к засолению почвы), а также комплексный анализ получаемых форм на всех этапах исследований. Актуальность, масштабность и практическая важность данного проекта определяется, прежде всего, высокой потребностью получения устойчивых к абиотическим стрессам растений при выращивании их в почвенно-климатических условиях различных регионов России. В предлагаемом проекте планируется проведение исследований для решения комплекса задач по повышению устойчивости винограда к к холодовым и ионным стрессам, вызванных засолением или засухой, с использованием методов редактирования генома, генетической и клеточной инженерии. Различные факторы транскрипции (такие как WRKY, MYB, ERF и семейства факторов транскрипции NAC) участвуют в модуляции транскрипции генов, чувствительных к солевому стрессу. Факторы транскрипции WRKY составляют одно из крупнейших семейств факторов транскрипции у растений и были обнаружены относительно недавно. Недавно VvWRKY13 был охарактеризован как отрицательный медиатор солевого стресса как с помощью анализа сортов винограда с различной устойчивостью к солевому стрессу, так и с помощью трансгенного арабидопсиса с оверэкспрессией VvWRKY13. В исследованиях Hou et al (2020) трансгенный арабидопсис с оверэкспрессией VvWRKY13 проявил повышенную чувствительность к стрессу от засухи по сравнению с диким типом. Исследования Huang et al (2020) продемонстрировали, что эктопическая сверхэкспрессия фактора транскрипции ананаса AcWRKY31 снижает засухо- и солеустойчивость трансгенного риса и арабидопсиса. Для точной идентификации функций генов семейства WRKY (VvWRKY13 / 31) винограда необходимы исследования на базе не только арабидопсиса, но и на целевой культуре - Vitis vinifera L. Мы предполагаем, что создание CRISPR/Cas9 мутантов по VvWRKY13 и VvWRKY31 (гомолога AcWRKY31) позволит комплексно создать генотипы перспективные для селекции засухо- и солеустойчивых сортов винограда, а проведение транскриптомного анализа позволит четко определелить их функциональную роль в транскрипции ассоциированных генов. Помимо засух и засоления почв, низкая температура является наиболее важным фактором окружающей среды, ограничивающим продуктивность и географическое распространение растений по всему миру. Большинство технических сортов винограда возделываемых в России происходит от европейских сортов. Хотя эти сорта обладают превосходными органолептическими качествами, они относительно плохо переносят холод зимой. Таким образом, низкая температура является одним из узких мест, сдерживающих дальнейший рост виноградарской отрасли России. Было найдено множество генов-кандидатов повышения холодоустойчивости, а исследования по оверэкспресии этих генов проводились на трансгенном арабидопсисе. На сегодняшний день крайне мало работ представлено по трансформации растительными генами устойчивости к холодовым стрессам именно целевых культур селькохоз значимых сортов. В наших предыдущих исследованиях из Eutrema salsugineum был выделен ген EsCSDP3, который участвует в акклиматизации растений к холоду. Мы предполагаем, что создание линий с оверэкспрессией EsCSDP3 позволит получить перспективный для селекции устойчивых к холодовым стрессам сортов винограда генотип.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


 

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В результате исследований созданы серии векторных конструкций для переноса в клетки винограда компонентов геномного редактирования (Cas9 и sgRNA), супрессии генов VvWRKY методом РНК интерференции для посттранскрипционного ингибирования генов семейства WRKY. Осуществлена трансформация, селекция и отбор новых модифицированных и геномно редактированных растений винограда. Создан набор экспрессионных векторных конструкций для создания химерных растений с модифицированной корневой системой с супрессией генов VvWRKY, кодирующих отрицательные модуляторы устойчивости к стрессам. Осуществлена химеризация растений винограда сортов Мерло и Академик Авидзба. Химерные растения с супрессией гена VvWRKY57 показали в полтора раза большую силу роста а присутствии 50 мМ NaCl в среде, чем контрольные образцы. Получен ряд линий винограда, несущих гены белков с доменом холодового шока как бактериального, так и растительного происхождения, под контролем как конститутивных, так и индуцибельных регуляторных элементов. Как показал ПЦР-анализ, все 16 линий содержали целевую последовательность гена холодового шока. Контаминации генами Vir-группы не обнаружено. Интеграция генов cspA-plant, Escsdp3 и nptII в геном винограда была подтверждена Саузерн-блоттингом. Число копий гена варьирует между линиями (12 линий с 1 локусом интеграции, 3 линии с 2 локусами и одна с 3 инсерциями в геном). Осуществлена индукция холодового стресса для линий винограда, несущих гены белков с доменом холодового шока. После промораживания при -16°С 3 трансгенные линии сохранили жизнеспособные почки на уровне до 5%. Осуществлен анализ паттернов экспрессии генов на основе транскриптомов модифицированных растений винограда (под воздействием холодовых стрессов и без них). В ходе анализа дифференциально экспрессирующихся генов в диких и модифицированных генотипах без воздействия холодового стресса было, обнаружено, что для генотипа CspA/RD29 характерными являются 185 генов, которые не изменяют своей экспрессии при воздействии холодового стресса в других генотипах. При этом только три гена дифференциально экспрессируются во всех ГМ-растениях при сравнении с диким генотипом. Все три гена достоверно повышают экспрессию в модифицированных растениях.

 

Публикации

1. Малетич Г., Пушин А., Долгов С., Хватков П. AGROBACTERIUM-MEDIATED TRANSFORMATION OF GRAPES VIA ORGANOGENESIS Материалы IV Международной научно-практической конференции «Геномика и современные биотехнологии в размножении, селекции и сохранении растений» GenBio2024 (год публикации - 2024)
10.18699/GenBio2024-36

2. Гавриленко И., Малетич Г., Челомбит С., Водясова Е., Тимербаев В., Синченко А., Долгов С., Хватков П. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ WRKY (ТФ) В ОТВЕТЕ РАСТЕНИЙ НА АБИОТИЧЕСКИЙ СТРЕСС Материалы IV Международной научно-практической конференции «Геномика и современные биотехнологии в размножении, селекции и сохранении растений» GenBio2024 (год публикации - 2024)
10.18699/GenBio2024-17

3. Синченко А., Водясова Е., Уппе В., Хватков П. Inter-varietal variability of transcription factor WRKY in Vitis vinifera based on transcriptomic data Генетика , геномика , биоинформатика и биотехнология растений 4-я Школа молодых ученых (год публикации - 2024)
10.18699/SBB-PlantGen-2024-37

4. Малетич Г.К., Гавриленко И.В., Пушин А.С., Челомбит С.В., Хмельницкая Т.В., Плугатарь Ю.В., Долгов С.В., Хватков П.А. Somatic embryogenesis and Agrobacterium-mediated transformation in a number of grape cultivars Plant Cell Tiss Organ Cult, Maletich, G., Gavrilenko, I., Pushin, A. et al. Somatic embryogenesis and Agrobacterium-mediated transformation in a number of grape cultivars. Plant Cell Tiss Organ Cult 160, 73 (2025). https://doi.org/10.1007/s11240-025-02997-5 (год публикации - 2025)
10.1007/s11240-025-02997-5