Технология высокопроизводительной молекулярной и клеточной диагностики здоровья гидробионтов для повышения эффективности аквакультуры

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-76-10051

НазваниеТехнология высокопроизводительной молекулярной и клеточной диагностики здоровья гидробионтов для повышения эффективности аквакультуры

Руководитель Сокольникова Юлия Николаевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского" Дальневосточного отделения Российской академии наук , Приморский край

Конкурс №85 - Конкурс 2023 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-201 - Рыбный промысел

Ключевые слова двустворчатые моллюски, аквакультура, биомониторинг, скрининг гидробионтов, молекулярно-генетический скрининг, морские биотехнологии, мониторинг здоровья, ветеринарные технологии, морские биоресурсы, патологии, инвазии, инфекции

Код ГРНТИ69.25.17

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Повышение эффективности аквакультуры и охрана здоровья водных организмов – две сопряженные проблемы, которые связаны с управлением биоресурсами в морских и пресноводных экосистемах. Одним из эффективных способов решения данных проблем является развитие инновационных подходов ветеринарного контроля состояния морских гидробионтов и среды их обитания. В настоящее время традиционным методом диагностики состояния двустворчатых моллюсков до сих пор остается весьма трудоемкий в технологическом плане гистологический анализ («Ветеринарно-санитарный кодекс МЭБ по водным животным»). Несмотря на то, что этот тип диагностики предоставляет исчерпывающую информацию о состоянии моллюсков и их патогенах, он отражает лишь морфологическую картину изменений, которая может быть отчетливо зарегистрирована в основном на поздних этапах развития патологий и не всегда однозначно свидетельствует о нарушении физиологических функций. Тогда как для создания корректного интегрального показателя состояния здоровья в диагностике необходимы истинно функциональные тесты. В этом контексте изменения показателей внутренней среды являются наиболее достоверным отражением механизмов адаптации организмов к условиям обитания. В аквакультуре рыб гематологический анализ давно зарекомендовал себя как надежный инструмент контроля их состояния и применяется в качестве рутинной процедуры диагностики заболеваний. В таком случае, гемолимфа моллюсков, являющаяся аналогом крови, выступает одним из наиболее перспективных и доступных инструментов диагностики здоровья этих организмов. Однако в настоящее время отсутствуют какие-либо работы, в которых был бы выполнен количественный анализ взаимосвязи параметров гемолимфы моллюсков и степени развития различных патогенетических процессов, которые вместе могут обеспечить действительно интегральную характеристику состояния этих организмов. В рамках предполагаемого исследования запланирован анализ активности гуморальных и клеточных факторов гемолимфы и данных молекулярно-генетического скрининга моллюсков в совокупности с количественной оценкой воздействия среды, патологий, инфекций и инвазий, в результате которого будут получены данные о референсных значениях иммунологических показателей, достоверно дифференцирующих нормальное состояние от патологического. Для определения дозозависимого эффекта влияния факторов на состояния моллюсков, в ходе реализации проекта предполагается адаптировать и верифицировать применение недавно разработанного коллективом проекта подхода количественной оценки физиологического статуса моллюсков, выраженного в интегральном индексе здоровья (Kumeiko et.al, 2018). Разработанный индекс включает исключительно проверенные биомаркеры, отражающие индуцированные изменения параметров организма, и является стандартизированным и универсальным методом, его можно экстраполировать на многообразие физиологических параметров и проводить, таким образом, комплексную оценку состояния здоровья гидробионтов. Новым направлением исследований станет разработка технологии оценки здоровья на основе NGS-технологии, которая в будущем позволит проводить массовые популяционные исследования инфекционного и физиологического статуса моллюсков в один шаг секвенирования. На основе иммунологических и гистологических данных и их связи с дифференциальной экспрессией генов будет проведен поиск ключевых молекулярных маркеров и детерминант, являющихся индикаторами функциональной активности клеток и физиологического состояния организма. Также на основе имеющихся данных и биоинформатического подхода будет разработана панель для выявления патогенов опасных не только для моллюсков, но и для человека. Итогом реализации проекта будет являться высокоэффективная технология ветеринарной экспресс-диагностики здоровья важнейших объектов аквакультуры, основанная на современных методах клеточной и молекулярной биологии, внедрение которой в практику повысит безопасность и эффективность ведения аквакультуры.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Тумас А.В., Слатвинская В.А., Кумейко В.В., Сокольникова Ю.Н. Tumas A.V., Slatvinskaya V.A., Kumeiko V.V., Sokolnikova Y.N. Study of the impact of the parasitic microalgae Coccomyxa parasitica on the health of bivalve Modiolus kurilensis // Microorganisms. 2024. Vol. 14(5). accepted MDPI, Vol. 12(5) (год публикации - 2024)
10.3390/microorganisms12050997

2. Гринченко А., Сокольникова Ю., Тумас А., Мокрина М., Цой Е., Кумейко В., Онищенко М. Grinchenko A., Sokolnikova Y., Tumas A., Mokrina M., Tsoy E., Buriak I., Kumeiko V., Onishchenko M. Hemolymph parameters are a useful tool for assessing bivalve health and water quality // Diversity. 2024. Vol. 16 (7). P. 404 MDPI, Vol. 16 (7). P. 404. (год публикации - 2024)
10.3390/d16070404

3. Цой Е.А., Буряк И.А., Гринченко А.В. Tsoy, E.A., Buriak, I.A. & Grinchenko, A.V. Carbohydrate-binding activities of agglutinins in bivalves from the Sea of Japan // Russ J Mar Biol. 2024. Vol. 50. P. 342–349. Springer Nature, Vol. 50. P. 342–349. (год публикации - 2024)
10.1134/S1063074024700470

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
На втором этапе проекта был проведен мониторинг комплекса физиологических показателей на различных уровнях организации для определения минимально необходимого, но достаточного набора биомаркеров, достоверно дифференцирующих состояние моллюсков при различных патогенетических процессах. В результате иммунологического анализа была установлена вариативность клеточных и гуморальных показателей гемолимфы в условиях нормы и их отклонение в условиях импактной акватории у гребешка приморского (Mizuhopecten yessoensis), устрицы гигантской (Magallana gigas), тихоокеанского петушка (Ruditapes philippinarum) и модиолуса курильского (Modiolus kurilensis) из залива Восток (референсная акватория) и Амурского залива (импактная акватория) залива Петра Великого Японского моря. Было выявлено, что у всех исследованных видов моллюсков достоверно изменяется фагоцитарная активность и содержание АФК, при этом показатель НСТ-теста повышается во всех четырех случаях у животных из импактной акватории. Тогда как фагоцитарная активность достоверно понижалась лишь у устрицы гигантской, модиолуса курильского и гребешка приморского, а у тихоокеанского петушка она снижалась. Концентрация общего белка плазмы также достоверно повышалась у всех видов моллюсков из импактной акватории, за исключением гребешка приморского. Кроме того, у модиолуса и петушка также наблюдалось повышение числа циркулирующих гемоцитов. В результате гистопатологического анализа было установлено, что наиболее выраженные изменения встречаются в почках у модиолуса курильского (степень выраженности 4), тогда как пищеварительная железа имела более выраженные изменения (3) у тихоокеанского петушка и гребешка приморского. У устриц изменения в равной степени (2) наблюдались как в жабрах, так и в пищеварительной железе. Анализ встречаемости гистопатологических отклонений в почках модиолуса показал, что наиболее часто (у 68% особей) изменяются параметры конкреций в трубочках (с преобладанием степени тяжести 4). С подобной частотой у данного вида моллюсков встречалось в почках также расслоение базальной мембраны (63%, степень тяжести 3). Наиболее выраженные изменения (3) в пищеварительной железе у моллюсков касались некротического разрушения трубочек (притом в основном у особей, выловленных из импактной акватории). Так, у гребешка подобные аномалии наблюдались у 52% особей, а у петушка – у 58% особей. Слабо выраженные (2) аномалии в жабрах встречались только у устриц и касались главным образом гипервакуолизации клеток (39% особей) и паразитарной инвазии (78% особей). У 90% особей модиолуса курильского также наблюдалась паразитарная инвазия, но она имела более слабую выраженность (1). У остальных видов паразиты в жабрах присутствовали не более чем в 21% случаев и имели также слабую выраженность (1). Паразитарные инвазии также встречались и в пищеварительной железе с одинаковой частотой у модиолуса и устрицы (22%). У гребешка паразиты в железе присутствовали лишь у 13% особей, а у петушка – у 9%. При этом степень выраженности инвазий варьировала у всех видов от 1 до 2. Анализ совокупной частоты встречаемости и степени выраженности патологий всех органов показал, что у устриц преобладали патологии средней степени выраженности (4) у 39 % особей, у модиолуса – у 50 % с высокой степенью выраженности (5-6), у петушка – у 46% (4) и у гребешка – у 35% (2). Подсчитанный гистопатологический индекс также был наиболее высокий у модиолуса курильского и касался он, главным образом, канальцев почек. Далее, учитывая иммунные и гистопатологические параметры животные были распределены на «здоровые» и «больные». После чего у них была проведена оценка инфекционного статуса, которая показала присутствие Perkinsus spp. лишь у 40% особей гребешка, Staphylococcus aureus у 80% модиолусов, 60% гребешков и 80% устриц, а Vibrio spp. у 40% петушков и 50% модиолусов. В результате комплексного анализа иммунологического, гистопатологического и инфекционного статуса были отобраны особи, для которых было выполнено выделения РНК и подготовлены библиотеки методом polyA селекции для дальнейшего полногеномного секвенирования транскриптома и его биоинформатического анализа. Дополнительно в сотрудничестве с аквафермерским хозяйством был проведен скрининг степени обсемененности простейшим паразитом Perkinsus гребешка приморского из бухты Воевода и предпринята попытка получения культуры данного патогена. В результате было обнаружено присутствие гипноспор Perkinsus в гемолимфе, жабрах, мантии, пищеварительной железе и на раковине моллюсков, среди которых наиболее обсемененной являлась гемолимфа. Самая высокая степень обсемененности жабр, мантии и пищеварительной железы наблюдалась у молодых особей, тогда как раковины и гемолимфы – у старшего возраста, что может указывать на их роль в качестве носителя Perkinsus. У младшей возрастной группы наблюдалась наибольшая концентрация белка в плазме, АФК у старшей группы, а фагоцитарной активности у средней группы. Высокая прямая коррелятивная связь между обсемененностью гемолимфы и концентрацией белка (0,64) у старших особей, и ее отсутствие у младших, может указывать на истощение гуморальных факторов у последних еще на этапе проникновения патогена через мантию и жабры, что и способствует его дальнейшему распространению по организму. Кроме того, было установлено, что из 15 протестированных штаммов бактерий агглютинация углевод-связывающим белком MkC1qDC из плазмы модиолуса курильского происходит в отношении всех штаммов. Бактериостатическая активность наблюдалась в отношении Pseudovibrio ascidiaceicola, Acinetobacter johnsonii, Lysinibacillus fusiformis и Cutibacterium. Полученные результаты показывают перспективность применения белка плазмы модиолуса как в биотехнологии аквакультуры, так и в биомедицины.

Публикации