Особенности экспрессии генов системы воспаления при гипоксии, клеточном старении и влиянии пептидных препаратов

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-14-00027

НазваниеОсобенности экспрессии генов системы воспаления при гипоксии, клеточном старении и влиянии пептидных препаратов

Руководитель Лимборская Светлана Андреевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" , г Москва

Конкурс №92 - Конкурс 2024 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика

Ключевые слова Функциональная геномика, ишемический инсульт, клеточные модели ишемии, оксидативный стресс, гипоксия, клеточное старение, воспаление, нейропротекция, регуляторные пептиды, пептидные препараты, транскриптомика, RNA-Seq, экспрессия генов, сравнительная геномика, полиморфные маркеры ДНК человека

Код ГРНТИ34.15.23

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
На сегодня достоверно установлено, что воспаление играет ключевую роль в патогенезе многих сложных социально-значимых заболеваний, включая ишемический инсульт. Изучение особенностей организации и функционирования генов системы воспаления при гипоксии, клеточном старении и под воздействием нейропротективных препаратов становится актуальной научной проблемой, направленной на решение многих задач, в том числе связанных с инсультом. Данный проект направлен на комплексное изучение работы генетических систем, контролирующих процесс воспаления в нервных клетках при ишемии и корректирующем воздействии инновационных синтетических пептидов, с целью разработки более эффективных подходов для профилактики и терапии ишемического инсульта. В проекте рассматривается серия пептидов – производных адренокортикотропного гормона (АКТГ(4-7)PGP, семакс), тафтцина (селанк) и коротких глипролинов (PGP), обладающих ярко-выраженной физиологической активностью при минимальных побочных эффектах. Методология исследования включает: 1) постановку клеточных моделей гипоксии/оксидативного стресса и старения клеток, отражающих отдельные ключевые события ишемического процесса; 2) полногеномный (RNA-Seq) анализ экспрессии генов в условиях моделей, в том числе при введении пептидов; 3) сравнение профилей дифференциальной экспрессии генов в условиях моделей на клеточных культурах с данными, полученными нами ранее в условиях модели ишемии-реперфузии (tMCAO) мозга у крыс; 4) анализ архитектуры (геномного полиморфизма) ДНК генов воспаления, значимо изменивших свою экспрессию в условиях модельных экспериментов, у лиц, перенесших острый ишемический инсульт. Более того, в проекте впервые планируется изучение роли генов системы воспаления в механизме действия пептидов путем ингибирования компонентов воспалительных сигнальных путей и последующего анализа экспрессии генов, что позволит пролить свет на то, как организована регуляция процесса нейропротекции, запускаемая пептидами в отношении системы воспаления. По результатам проекта будет сформировано более полное понимание событий при инсульте при соотнесении транскриптомных данных, полученных на организменном и клеточном уровнях. Будет выявлена роль генов воспаления в процессах повреждения нервных клеток, а также влиянии на них нейропротекции, запускаемой пептидами. Будет оценена их роль в развитии постинсультных осложнений у человека и предложена концепция по возможности коррекции их активности для повышения эффективности реабилитационных и лечебных мероприятий у лиц, перенесших инсульт.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В отчетный период были поставлены модели гипоксии и оксидативного стресса (ОС) клеточных культур человека, которые отражают важные стадии ишемического каскада. Клетки нейробластомы человека SH-SY5Y вводили в состояние гипоксии действием азида натрия (3 мМ, 1 ч) и ОС действием перекиси водорода (40 мкМ, 20 минут). Далее нами было изучено влияние пептидов АКТГ(4-7)PGP (семакса), производного тафцина (селанка) и PGP в условиях моделей. Показано, что в условиях модели химической гипоксии введение в культуральную среду и инкубация в течение ночи семакса или селанка после воздействия азида натрия в кислом буфере в течение часа достоверно повышало выживаемость клеток. По данным МТТ теста выживаемость клеток после действия азида натрия и ночного культивирования со средой показала 61 ± 1,8 %, семакс повышал выживаемость клеток на 17 %, селанк на 8 %, а PGP достоверно не влиял на выживаемость клеток. В условиях модели ОС введение в культуральную среду и инкубация в течение ночи семакса или селанка в среде без сыворотки достоверно снижало долю клеток округлой формы, оцененную с помощью микроскопического исследования. Доля клеток округлой формы после воздействия перекиси водорода составила 48,3 ± 1,9 %. В этих условиях семакс снижал долю клеток округлой формы до 28,4 ± 2,4 %, селанк - до 37,6 ± 2 %, а PGP достоверно не влиял на данный параметр. Из клеток, подвергнутых действию перекиси водорода и пептидов, в условиях модели ОС были получены образцы суммарной РНК и проведено полногеномное РНК-секвенирование (RNA-Seq) фракции полиА-РНК данных образцов Были получены архивы первичных прочтений для дальнейшего количественного и функционального биоинформатического анализа. Воспаление играет ключевую роль в патогенезе многих сложных социально-значимых заболеваний, включая ишемический инсульт (ИИ). Несмотря на наличие уже известных генов воспаления, задействованных в патогенезе ИИ, остается открытым вопрос оценки их общего числа и возможности обнаружения новых. В настоящей работе был проведен поиск и отбор генов, рассматриваемых в современной парадигме медико-биологических знаний как задействованных в воспалительных системах и процессах относящихся к сердечно-сосудистым заболеваниям (ССЗ) и более конкретно к ИИ. Используя открытые источники в Интернете, в частности, базу данных заболеваний DisGeNet были сформировали списки генов, ассоциированные с ИИ (N=1177) и ССЗ (N=1756). Наборы генов включали как гены предрасположенности, так и гены, ассоциированные с течением заболевания. В ходе анализа их рассмотрели совместно. Гены воспаления и иммунного ответа отобрали, используя гены биологических процессов генных онтологий (Gene Onthology), базы данных генов NCBI и путей Reactome, а также опубликованные в литературе списки генов воспаления человека. Всего получилось восемь наборов генов воспаления и иммунного ответа с общим числом генов равным 4586. Дополнительный список из 163 генов воспаления сформировали на основе ранее полученных нами данных об экспрессии их ортологов в модели ишемического инсульта у крыс tMCAO. Совокупный список генов воспаления, найденных как ассоциированных с ИИ или ССЗ по результатам анализа баз данных, и объединённый с генами воспаления, ортологи которых изменили экспрессию при tMCAO у крыс, включал 1300 генов. Гены NFKB1, RELA, IL1B, TLR2, CD14, CD40, HMGB1 показали максимальную встречаемость в различных исследуемых нами ресурсах для отбора генов воспаления. Дополнительно анализ научной литературы и баз генотипов показал, что гены воспаления чаще ассоциировали со степенью тяжести протекания ИИ, чем с предрасположенностями к нему. Для изучения связи полиморфных вариантов перспективных локусов ДНК у пациентов с ИИ методом ПЦР в реальном времени была сформирована репрезентативная выборка больных и здоровых лиц контрольной группы. В группу больных были отобраны мужчины и женщины в возрасте 55 лет и старше, у которых был диагностирован первый ИИ и которые были доставлены в больницу во время острой стадии заболевания, а в группу контроля - индивиды того же возраста, но без острых нарушений мозгового кровоснабжения в анамнезе. Чтобы получить этнически однородную выборку, в исследование включались только индивиды, относящие себя к русскому этносу. Итоговая выборка включала 331 больного с ИИ (166 мужчин и 165 женщин, средний возраст 71,68 ± 8,69 лет) и 222 индивида контрольной группы (109 мужчин и 113 женщин, средний возраст 70,20 ± 9,63 лет). Таким образом, планы по проекту, намеченные на 2024 года выполнены полностью. С учетом задела 2024 года, в 2025 году будут получены данные о профиле экспрессии генов воспаления в условиях ОС и действия пептидов. Также будет проведено генотипирование отобранных локусов генов воспаления, экспрессия которых специфична изучаемым воздействиям.

Публикации

1. Филиппенков И.Б.,. Глазова Н.Ю., Себенцова Е.А., Ставчанский В.В., Андреева Л.А., Мясоедов Н.Ф., Левицкая Н.Г., Лимборская С.А.,. Дергунова Л.В. Changes of Transcriptomic Activity in Rat Brain Cells under the Influence of Synthetic Adrenocorticotropic Hormone-Like Peptides Biochemistry (Moscow) (Биохимия), ISSN 0006-2979, Biochemistry (Moscow), 2024, Vol. 89, No. 9, pp. 1643-1656 (год публикации - 2024)
10.1134/S0006297924090104

2. Филиппенков И.Б., Шпетко Ю.Ю., Алес Д.А., Ставчанский В.В., Денисова А.Е., Южаков В.В., Фомина Н.К., Губский Л.В., Андреева Л.А., Мясоедов Н.Ф., Лимборская С.А., Дергунова Л.В. Genes that Associated with Action of ACTH-like Peptides with Neuroprotective Potential in Rat Brain Regions with Different Degree of Ischemic Damage International Journal of Molecular Sciences, 26(13):6256 (год публикации - 2025)
10.3390/ijms26136256

3. Филиппенков И.Б., Шпетко Ю.Ю., Ставчанский В.В., Денисова А.Е., Южаков В.В., Фомина Н.К., Губский Л.В., Лимборская С.А., Дергунова Л.В. Differentially Expressed Genes in Rat Brain Regions with Different Degrees of Ischemic Damage International Journal of Molecular Sciences, 26(5):2347 (год публикации - 2025)
10.3390/ijms26052347

4. Филиппенков И.Б., Шпетко Ю.Ю., Ставчанский В.В., Денисова А.Е., Губский Л.В., Андреева Л.А., Мясоедов Н.Ф., Лимборская С.А., Дергунова Л.В. ACTH-like Peptides Compensate Rat Brain Gene Expression Profile Disrupted by Ischemia a Day after Experimental Stroke biomedicines (год публикации - 2024)

5. Сударкина О.Ю., Гурьянова Е.В., Алес Д.А., Мясоедов Н.Ф., Лимборская С.А., Дергунова Л.В., Филиппенков И.Б. Synthetic ACTH analogue impacts on gene expression pattern of SH-SY5Y human neuroblastoma cells under peroxide oxidative stress European Journal of Human Genetics, 33(Suppl 1):110-507. doi: 10.1038/s41431-025-01934-6 (год публикации - 2025)

6. Хворых Г.В., Филиппенков И.Б., Хрунин А.В., Дергунова Л.В., Лимборская С.А. Identification of inflammation-associated genes linked to ischemic stroke European Journal of Human Genetics, 33(Suppl 1):110-507. doi: 10.1038/s41431-025-01934-6 (год публикации - 2025)

7. Филиппенков И.Б., Дергунова Л.В., Мясоедов Н.Ф., Лимборская С.А. Транскриптомный анализ клеток мозга модельных животных при ишемическом повреждении и действии пептидных препаратов Медицинская генетика, Том 24, № 7, c. 112-113 (год публикации - 2025)
10.25557/2073-7998.2025.07.112-113

8. Филиппенков И.Б., Глазова Н.Ю., Себенцова Е.А., Ставчанский В.В., Сударкина О.Ю., Андреева Л.А., Мясоедов Н.Ф., Левицкая Н.Г., Лимборская С.А., Дергунова Л.В. Изменения транскриптома клеток лобной коры мозга крыс под влиянием синтетического аналога тафтсина (селанка) Биотехнология, том 41, № 4, с. 39–41 (год публикации - 2025)
10.56304/S0234275825040118

9. Мозговой И.В., Шпетко Я.Ю., Денисова А.Е., Ставчанский В.В., Виноградина М.А., Губский Л.В., Дергунова Л.В., Лимборская С.А., Филиппенков И.Б. Дифференциальная экспрессия циклических РНК во фронтальной коре мозга крыс в условиях ишемии-реперфузии Биохимия, том 90, вып. 5, с. 611 – 626 (год публикации - 2025)
10.31857/S0320972525050025

10. Алес Д.А., Филиппенков И.Б., Ставчанский В.В., Денисова А.Е., Губский Л.В., Андреева Л.А., Дергунова Л.В. Потенциальные генетические механизмы действия нейропротективного пептида АКТГ(4-7)PGP (семакс) в областях мозга крыс с ишемическим повреждением 3rd Congress of International Society for Clinical Physiology & Pathology (ISCPP2025), (Moscow, Russia, May 12-14, 2025), p. 101-102 (год публикации - 2025)

11. Шпетко Я.Ю., Ставчанский В.В., Денисова А.Е., Губский Л.В., Андреева Л.А., Мясоедов Н.Ф., Лимборская С.А., Дергунова Л.В., Филиппенков И.Б. Транскриптомные сигналы нейропротективного влияния синтетических пептидов на основе адренокортикотропного гормона во фронтальной коре мозга крыс через 24 часа после ишемии-реперфузии 3rd Congress of International Society for Clinical Physiology & Pathology (ISCPP2025), (Moscow, Russia, May 12-14, 2025), p. 103-104 (год публикации - 2025)

12. Алес Д.А., Филиппенков И.Б., Ставчанский В.В., Денисова А.Е., Губский Л.В., Андреева Л.А., Дергунова Л.В. Гены, связанные с действием нейропротекторного пептида АКТГ(4-7)PGP (семакс) в областях мозга крыс с различной степенью ишемического повреждения Биотехнология, том 40, № 7, с. 15 (год публикации - 2024)
10.56304/S0234275824070056

13. Гурьянова Е.В., Сударкина О.Ю., Алес Д.А., Мясоедов Н.Ф., Дергунова Л.В., Филиппенков И.Б. Изучение экспрессии генов в клетках нейробластомы человека (SH-SY5Y) в условиях оксидативного стресса и под воздействием синтетических пептидных препаратов 3rd Congress of International Society for Clinical Physiology & Pathology (ISCPP2025), p. 104-105 (год публикации - 2025)

14. Филиппенков И.Б., Дергунова Л.В., Лимборская С.А., Мясоедов Н.Ф. Синтетические пептиды как природоподобные лекарства: транскриптомные подходы к их исследованию в модели ишемического инсульта Биотехногия, том 40, № 7, с. 55–56 (год публикации - 2024)
10.56304/S023427582407161X

15. Филиппенков И.Б., Шпетко Ю.Ю., Лимборская С.А., Дергунова Л.В. Comparison of ipsilateral striatum and frontal cortex differential expression gene patterns in rat brain following experimental stroke European Journal of Human Genetics, 33(Suppl 1):110-507. doi: 10.1038/s41431-025-01934-6 (p. 460-461) (год публикации - 2025)

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В отчётный период с использованием RNA-Seq была определена транскрипционная активность 22368 генов (мРНК) в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y в условиях оксидативного стресса (ОС) и при введении в этих же условиях пептидов АКТГ(4-7)PGP (семакса), селанка и PGP. Были выявлены десятки генов, дифференциальная экспрессия которых ассоциирована с эффектом ОС и влиянием пептидов в условиях ОС. С помощью ПЦР в реальном времени верифицированы результаты RNA-Seq, выявившие изменения дифференциальной экспрессии генов под влиянием ОС. Нам удалось показать, что по данным функционального обогащения David 2021, под действием ОС происходит активация генов систем регуляции клеточного цикла, главного комплекса гистосовместимости, метаболизма холестерина, роста аксонов и других. В то же время пептиды селанк и PGP демонстрируют сонаправленное ОС действие на работу генов данных клеточных систем. Семакс проявляет менее выраженное влияние, оказывая подавляющее действие на экспрессию генов систем рецепторов-«мусорщиков» класса А и метаболизма холестерина. Дополнительно был изучен эффект пептида АКТГ(6-9)PGP в условиях ОС. Пептид был способен уменьшать вызванные ОС изменения в экспрессии 93 генов и контролировать метаболические системы в модели клеточного уровня. Отдельные гены были также выявлены нами в числе генов воспаления, общий список которых был сформирован в первый год выполнения проекта. Для поиска генов, связанных с ОС, как одним из механизмов ишемического повреждения, а также генов, специфичных действию пептидов в условиях ОС, было проведено сравнение профилей экспрессии генов в клетках нейробластомы человека в условиях ОС и в участках мозга крыс в условиях модели обратимой окклюзии правой средней мозговой артерии (tMCAO), поставленной нами ранее. Рассматривались участки фронтальной коры через 4,5ч и 24 ч после tMCAO, содержащей преимущественно зону здоровой ткани и пенумбры, а также стриатума через 24 ч после tMCAO, содержащего преимущественно зону ишемического очага. Нами были проанализированы наборы генов, характеризующих действие ОС, а также пептидов и найдены ортологичные им гены. В результате, профили дифференциально экспрессированных генов (ДЭГ) в сравнениях, характеризующих влияние ОС и пептидов на клетки нейробластомы человека, и действие ишемии на участки мозга крыс заметно отличаются, что указывает на специфичность функционирования нервных клеток в условиях ОС, а также специфичность действия пептидов в условиях ОС и ишемии. Следующим этапом стал анализ полиморфизма генов воспаления, задействованных в реакциях воспаления в условиях окислительного стресса. Материалом для исследования стали генотипические данные по 68 ДЭГ, связанных с воспалением, в условиях ОС, идентифицированные в этом проекте на линии клеток нейробластомы человека SH-SY5Y. Кроме того, использовались данные популяции CEU из проекта 1000 Genomes (Phase III), локусы количественных признаков cis eQTL в мозге, сосудах и крови, генотип-фенотипические данные когорты 4929 больных ишемическим инсультом (ИИ) из западной Европы и 652 лиц контрольной группы, охарактеризованные по 883749 аутосомным однонуклеотидным полиморфизмам (SNPs). В результате мы выявили 7 генов-кандидатов (JUN, ITPR1, HGF, NRG1, LSP1, STIM1 и F10) ишемического инсульта с уровнем значимости p value < 5 ×10-4. На следующем этапе была проведена дискриминация аллельных вариантов, отобранных на предыдущем этапе локусов с помощью ПЦР в реальном времени в режиме TaqMan, и изучение связей (ассоциаций) между отдельными SNPs и различными фенотипами больных ишемическим инсультом. Исследование проведено в группе из 331 пациентов с ишемическим инсультом и 222 индивидов контрольной группы, собранных и детально охарактеризованных в отчете за первый год работы над проектом. Пациенты были разделены на группы функционального и нефункционального восстановления в зависимости от баллов mRS модифицированной шкалы Рэнкина. Были генотипированы SNPs в генах LSP1 (rs907611 и rs2089910) и LGALS3 (rs66782529 и rs1009977), связанные с воспалением. Значимые ассоциации были установлены при анализе динамики изменения функционального статуса пациентов с 1 на 14 сутки (∆mRS): rs66782529 в гене LGALS3 (p=0,049) и rs907611 в гене LSP1 (p=0,049). Также в рамках работы над проектом была поставлена модель клеточного старения (КС) (с применением D-галактозы с введением в тех же условиях пептидов семакса, селанка и PGP. Морфологию клеток оценивали с помощью световой микроскопии. Для анализа выживаемости использовали МТТ-тест. В этих условиях 150 мМ галактоза снизила выживаемость клеток по сравнению с контролем на 58 % (до 42 ± 2 %, р < 0.001), семакс (1 мМ) повысил выживаемость на 11% (до 53 ± 2 %, p < 0.05), селанк и PGP (также по 1 мМ) повысили выживаемость клеток недостоверно до 46 ± 3% и 44 ± 2% соответственно. Вышеописанные условия модели клеточного старения были использованы для получения образцов РНК для RNA-Seq анализа. Была выделена суммарная РНК из образцов каждой из 5 групп «контроль», «галактоза», «галактоза+семакс», «галактоза+селанк» и «галактоза+PGP» (по 3 образца в каждой группе). Далее из полиА РНК были приготовлены кДНК-библиотеки для массового параллельного секвенирования. Таким образом, были подготовлены образцы модели КС для дальнейшего анализа с помощью RNA-Seq. Все намеченные на 2025 год в проекте планы достигнуты.

Публикации