Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В 2024 году исследования проводились по восьми основным направлениям. 1. Анализ организации теломерной ДНК у насекомых. Проведен анализ геномных сборок 125 видов насекомых из 10 отрядов. У 114 видов их отрядов Archaeognatha, Zygentoma, Mantodea, Thysanoptera и Megaloptera и Lepidoptera на концах хромосом выявлен стандартный пятибуквенный мотив TTAGG. Наиболее интересные результаты были получены при изучении уховерток (отряд Dermaptera), для которых ранее организация теломерной ДНК была неизвестной. Показано, что у Dermaptera теломерная ДНК состоит из повторов мотива TTCGG, который ранее для насекомых не приводился. 2. Валидация полученных биоинформатических данных по структуре теломерных мотивов с использованием метода FISH. Результаты по структуре теломерных мотивов, полученные на основании анализа геномных сборок нуждаются в валидации методами экспериментальной биологии. Хорошим способом такой валидации является метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), позволяющий визуализировать теломеры на цитологических препаратах. В 2024 году такой анализ был проведен в частности для представителей отряда Hemiptera. Использование зонда (TTAGGGATGG)n выявило отчетливые гибридизационные сигналы на концах хромосом у видов рода Cimex, что доказывает на наличие теломерного мотива (TTAGGGATGG)n, ранее предсказанного биоинформатически. Наличие канонического мотива TTAGG подтверждено для чешуекрылых. 3. Сравнительный анализ хромосомных сборок геномов видов рода Polyommatus и выявление хромосомных перестроек с использованием методов биоинформатики. Род Polyommatus (Lepidoptera, Lycaenidae) и сестринский ему род Lysandra – это модельные объекты наших исследований по изучению хромосомной эволюции и видообразования. Поэтому для выявления синтенных регионов хромосом, а также внутри- и межхромосомных перестроек мы сделали попарные сравнения полнохромосомных сборок геномов для видов этих родов. Были выявлены аутосомные слияния хромосом, слияния и разделения, включающие половые хромосомы, а также инверсии, разделяющие виды. Подтверждено наличие двух трендов хромосомной эволюции в семействе Lycaenidae: консервативного тренда с сохранениям анцестрального числа хромосом и быстрой хромосомной эволюции за счет многочисленных слияний/разделений хромосом. 4. Валидация имеющихся в ГенБанке хромосомных сборок геномов Polyommatus и близких родов путем классического цитогенетического анализа Результатом геномных сборок, дополненных Hi-C анализом, являются скаффолды в виде так называемые псевдохромосом, которые полностью (в идеале) или частично (из-за ошибок сборки) соответствуют реальным хромосомам. Валидация таких сборок методами классической цитогенетики крайне желательна, так как позволяет выявить возможные ошибки сборки. В 2024 году мы провели такую валидацию для тех видов голубянок рода Polyommatus и близких родов, для которых уже есть информация по геномным сборкам (P. icarus, P. iphigenia, P. daphnis, P. argus, C. argiolus, C. semiargus) или которые находятся в процесс секвенирования и сборки геномов (Polyommatus surakovi, P. yeranyani, P. damon, P. pseudactis, P. eriwanensis, P. damocles, P. damone). 5. Проверка гипотезы, согласно которой митохондриальные и ядерные геномы видов Polyommatus morgani, P. karindus и P. peilei, обитающих симпатрично, имеют низкий уровень генетических различий, сохраняя дифференциация по таким ключевым параметрам как разная окраска крыльев и разное число хромосом. Проведен демографический анализ, основанный на сравнении правдоподобия разных моделей эволюции в изученной тройке видов. Анализ показал, показал, что, скорее всего, около 20000 лет назад от общего предка возникли две линии: линия karindus и линия morgani+peilei. Хотя эти две линии эволюционировали независимо, существовал поток ядерных генов от линии morgani+peilei к линии karindus. Затем, около 4500 лет назад произошло разделение линии morgani+peilei на современные виды morgana и peilei. Интересно, что был выявлен поток ядерных генов от morgani+peilei к линии karindus, в то время как для митохондриальных генов была выявлена интрогрессия в обратном направлении: от karindus к morgani+peilei. 6. Изучение роли хромосомной дифференциации и хромосомной гетерозиготности в возникновении и поддержании репродуктивной изоляции между видами (на примере рода Polyommatus). Целью этой части работы являлся анализ влияния хромосомных перестроек и гетерозиготности по хромосомным перестройкам на мейоз и выживаемость гибридных особей. В природе был получен живой материал по 15 видам родов Polyommatus и Lysandra, с особым акцентом на виды, которые имеют контрастные различия в гаплоидном числе хромосом (n). Для все собранных видов были сделаны попытки получения межвидовых гибридов в разных комбинациях видов. Во все случаях параллельно ставился контроль по проведению конспецифичных скрещиваний. Большинство попыток межвидовых скрещиваний оказались неудачными из-за выраженной прекопуляционной и копуляционной изоляции. Исключением являлся вариант самки L. coridon (n=90) х самцы P. daphnis (n=24). Это было неожиданным для нас, так как эти бабочки относятся к разным родам и имеют максимальные различия в числе хромосом (n=90 vs n=24). Эта пара была выбрана для дальнейших экспериментов и анализов. Получены первые результаты по выживаемости гусениц F1 и по анализу поведения хромосом в мейозе у гибридных бабочек. 7. Сравнительный анализ геномов видов рода Dendrolimus – наиболее серьезных вредителей хвойных лесов. Сравнение геномов D. kikuchii, D. pini, D. houi и D. punctatus показало, что три первых вида сохраняют кариотип, близкий к анцестральному. Неожиданный результат был получен при изучении генома D. punctatus. Кариотип этого вида оказался полностью перестроенным за счет накопления 70 внутрихромосомных перестроек – инверсий, крупных внутрихромосомных транслокаций и внутрихромосомных транслокаций, совмещенных с инверсиями. Наиболее удивительным оказалось строение хромосомы 29. При сравнении с анцестральным кариотипом видно, что эта хромосома состоит их шести перестроенных блоков, которые имеют случайный порядок и ориентацию по сравнению с исходным геномом. Считается, что подобное строение характерно для хромосом, которые возникают в результате процесса, называемого хромотрипсис. В целом, выявленный случай быстрой хромосомной эволюции в роде Dendrolimus кажется интересным и заслуживающим дальнейшего изучения, в том числе за счет повторной сборки генома D. punctatus. 8. ДНК-баркодинг дневных бабочек России и полевые исследования. Собрано около 2200 экземпляров дневных бабочек, относящихся приблизительно к 330 видам. Получены ДНК-баркоды для ~ 950 особей, относящихся к 270 видам. Из этих баркодов ~450 были получены из старого коллекционного материала, ~ 500 баркодов получены из особей, собранных в 2024 году (~150 из Ульяновской области, ~50 из Саратовской области, ~50 с Северного Кавказа и ~250 из Республики Алтай).

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В 2025 году исследования в рамках проекта проводились по всем запланированным направлениям, включая (1) изучение организации и эволюции теломерной ДНК у насекомых, (2) сравнительный анализ геномов, в том числе у видов – вредителей леса, (3) валидацию результатов, полученных in silico, с использованием классической и молекулярной цитогенетики, (4) эксперименты по межвидовой и межродовой гибридизации между хромосомно- дифференцированными видами, а также (5) ДНК-баркодинг и молекулярную систематику. (1) Впервые в мировой практике было проведено провели массированное исследование разнообразия молекулярной структуры тепломерных мотивов у насекомых, основанное на одновременном (параллельном) использование цитогенетического и биоинформатического подходов. Теломеры – структуры, находящиеся на концах хромосом, обеспечивают целостность и точную репликацию хромосом, и играют существенную роль в механизмах, определяющих процессы клеточного старения и продолжительность жизни живых организмов. Еще недавно считалось, что организация теломер очень консервативна у всех эукариот, и у всех насекомых, за немногими исключениями, теломерная ДНК состоит из повторяющейся последовательности ТТАGG. Только недавно и отчасти из наших исследований стало известно, что теломерные мотивы насекомых очень разнообразны, хотя до сих пор плохо изучены. Для изучения теломер традиционно используется цитогенетический подход, основанный на физическом картировании мотивов с применением метода флуоресцентной гибридизации ДНК (FISH). Этот подход эффективен в тех случаях, когда имеется гипотеза о теломерных последовательностях ДНК в конкретной группе. Наши исследования предыдущих лет показали, что такие гипотезы можно выдвигать, используя биоинформатический подход, основанный на анализе геномных сборок. В 2025 году мы объединили эти два подхода для изучения структуры теломер уховерток, цикадовых, кокцид, тлей и клопов. Вначале, мы проанализировали доступные в базе NCBI геномные сборки для этих насекомых и выявили восемь вариантов теломерных последовательностей. Среди них преобладал канонический мотив TTAGG, который рассматривается как анцестральный для насекомых. Наибольшее разнообразие мотивов было выявлено у клопов из эволюционно молодой клады Terheteroptera (Cimicomorpha+Pentatomomorpha). Далее, мы разработали зонды для физического картирования мотивов, найденных у клопов, и провели FISH-эксперименты на хромосомах представителях семейств Reduviidae, Anthocoridae, Miridae (Cimicomorpha), Blissidae, Lygaeidae, Pentatomidae, Rhopalidae, Alydidae, Geocoridae и Coreidae (Pentatomomorpha). Анцестральный мотив TTAGG был обнаружен только у Reduviidae, в то время как в других семействах были найдены производные мотивы TTAGGGGTGG (у Pentatomomorpha) и TTAGGGATGG (в обоих инфраотрядах). На основе полученных данных, мы высказали ряд гипотез, в том числе о том, что последовательность TTAGGGATGG является предковой для всей клады Terheteroptera. Наши исследования показали высокую эффективность совместного использования цитогенетического и биоинформатического подходов для изучения теломер. Особенностью организации теломер некоторых отрядов, подотрядов и инфраотрядов насекомых является наличие в их структуре теломероспецифичных ретротранспозонов, образующих две группы, SART и TRAs- ретротранспозоны. В 2025 году теломероспецифичные ретротранспозоны были выявлены у всех исследованных видов из отрядов Lepidoptera, Trichoptera и Hymenoptera. При изучении Hemiptera, впервые были обнаружены SART-элементы у тлей (Aphididae), щитовок (семейство Eriococcidae) и в трех семействах клопов из инфораотряда Pentatomomorpha (Coreidae, Pentatomidae и Acanthosomatidae). SART- и TRAS-элементы были впервые найдены у мучнистых червецов (семейство Pseudococcidae). Однако SART- и TRAS-элементы отсутствовали в теломерах цикадок Cicadellidae и у клопов инфраотряда Gerromorpha (Gerridae). (2) С целью изучения роли межвидовой гибридизации в эволюция геномов и видообразовании у голубянок рода Polyommatus было осуществлено полногеномное секвенирование 30 образцов P. morgani, P. karindus и P. peilei из зоны их аллопатрии с получением коротких ридов. В настоящее время осуществляется сборка геномов полученных образцов с использования метода ресеквенироания. В качестве референса используется имеющаяся в ГенБанке высококачественная сборка генома близкого вида Polyommatus icarus. Проведен сравнительный анализ геномов бабочек-шелкопрядов, относящихся к группам наиболее опасных вредителей леса (роды Dendrolimus и Lymantria) и бабочек-чернушек рода Erebia с различными числами хромосом. Проведен анализ эволюции геномов и кариотипов в роде Coleophora, в котором ранее были выявлены виды с удвоенным числом хромосом и приблизительно удвоенным содержанием ДНК. Не подтверждена гипотеза о тетраплоидном происхождении этих видов. Показано, что высокохромосомные виды возникали вследствие фрагментации хромосом и увеличения содержания повторенных элементов в геноме. (3) Для валидации хромосомных чисел в изученных геномных сборках, часть видов была кариотипирована с использованием методов классической цитогенетики. (4) В лабораторных условиях получены межродовые гибриды F1 бабочек-голубянок Lysandra coridon (n=90) x Polyommatus daphnis (n=24) и Lysandra coridon (n=90) x Polyommatus thersites (n=24) (в скобках указаны гаплоидные числа хромосом), различающихся множественными разделениями хромосом. Гибриды демонстрировали высокую жизнеспособность, но оказались полностью стерильными. Цитологический анализ гибридов F1 показал, что несмотря на то, что изученные виды относятся к разным родам и имеют чрезвычайные различия в числе хромосом, их мейоз не так сильно нарушен, как это можно было бы ожидать. Скорее всего, это связано с простым характером хромосомных перестроек, разделяющих эти виды. (5) Для Волго-Уральского региона и юга Западной Сибири подготовлена библиотека ДНК-баркодов дневных бабочек. Для Ульяновской области эта библиотека опубликована. На основании анализа полученных ДНК-баркодов сделаны работы по молекулярной систематике следующих родов чешуекрылых насекомых: Phoenicurusia (Lepidoptera, Lycaenidae), Palaeophilotes (Lepidoptera, Lycaenidae), Lyela (Lepidoptera, Nymphalidae), Aporia (Lepidoptera, Pieridae), Pontia (Lepidoptera, Pieridae), Catarhoe (Lepidoptera: Geometridae) и Brahmaea (Lepidoptera: Brahmaeidae) и Dzhugesia (Lepidoptera: Geometridae) (Hamyab, Makhov, Mokhtari, 2025). По результатам исследования по гранту в 2025 года опубликовано 13 статей (все в журналах из белого списка и базы WEB of Science Core Collection, из них 4 статьи в журналах Q1). Все запланированные в отчетном периоде научные результаты достигнуты.