Органоминеральные комплексы с пробиотической и противоопухолевой активностями для восстановления микробиоты и поддержания здоровья кишечника

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-14-00059

НазваниеОрганоминеральные комплексы с пробиотической и противоопухолевой активностями для восстановления микробиоты и поддержания здоровья кишечника

Руководитель Ильинская Ольга Николаевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" , Республика Татарстан (Татарстан)

Конкурс №92 - Конкурс 2024 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые слова микробиота, метагеномный анализ, желудочно-кишечный тракт, цеолит, полисахаридный гель, химиотерапия, рибонуклеазы, противоопухолевая активность

Код ГРНТИ34.15.19

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Неотъемлемая часть человеческого организма, микробиота кишечника, развивается параллельно с развитием хозяина и сохраняет базовую стабильность и разнообразие. Динамическая композиция микробиоты варьируется в зависимости от индивида, его образа жизни и состояния здоровья. Современное понимание функциональной роли микробиоты кишечника в иммунологическом, метаболическом и неврологическом статусе организма инициировало создание новых полимикробных пробиотических препаратов, включающих сорбент-носитель или полимерную капсулу для защиты бактерий от агрессивной среды желудка. Однако обеспечение пролонгированного выхода пробиотика либо метабиотика в желудочно-кишечном тракте остается серьезной актуальной проблемой, которую невозможно решать без накопления фундаментальных знаний о структуре носителя и его динамичном взаимодействии с целевым агентом, а также без доказательных данных об устойчивости, эффективности и безопасности препарата. Исследования последнего десятилетия установили, что дисбиоз кишечника сопровождает колоректальный онкогенез и может быть его причиной. Оптимизация состава микробиоты предполагает разработку таргетных микробных средств в качестве химиопрофилактических против колоректального рака, в качестве адъювантов при химиотерапии и иммунотерапии для повышения эффективности лекарств и восстановления микробиоты. К таким средствам могут быть отнесены и некоторые метаболиты бактерий, в частности, секретируемые РНКазы с противоопухолевыми свойствами. Настоящий проект ставит целью определение восстанавливающего эффекта пробиотических бактерий на минеральных носителях по отношению к микробиому лабораторных мышей, подвергнутых модельной химиотерапии фторурацилом – препаратом первой линии борьбы с колоректальным раком, а также анализу противоопухолевых свойств РНКазы, иммобилизованной на цеолите. Для этого будет охарактеризован минеральный носитель, а именно клиноптилолит-содержащая порода Татарско-Шатрашанского месторождения, установлена его структура, элементный состав, эквивалентный диаметр и распределение пор; проведена трибомеханическая и термическая и обработка минерала для повышения его сорбционной емкости и определения оптимальных условий загрузки пробиотиками либо РНКазой. Полученные образцы должны обеспечить пролонгированный выход и длительное сохранение целевых активностей, что будет проверено экспериментально. Использование методов сканирующей атомно-силовой микроскопии, рентгеновской компьютерной томографии, метагеномного анализа сообществ кишечных бактерий, анализа хромосомных аберраций в периферической крови животных и цитометрии наряду с классическими методами культивирования бактерий, определением уровня антагонистической и ферментативных активностей, продукции перекиси водорода и органических кислот позволит сделать обоснованный вывод о возможности применения гибридных органоминеральных комплексов с пробиотической и противоопухолевой активностями в качестве средств поддерживающей терапии при колоректальном раке.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Настоящее исследование проведено с целью подтверждения пригодности природных клинптилолит-содержащих пород в качестве носителей пробиотических бактерий и белков-ферментов с потенциальным противоопухолевым действием. В настоящее время широко рекламируются пробиотические БАДы, в том числе содержащие цеолит. Например, «Литовит С» (Нов Агро, Россия), состоящий из природного цеолита (или, что более вероятно, цеолитсодержащей породы, пшеничных, ржаных отрубей, бифидобактерий и лактобактерий; «ЛБ-комплекс Л» (Институт им. академика И.Н. Блохина, Нижний Новгород, Россия) – жидкий пробиотик, представляющий собой консорциум живых антагонистически активных штаммов бифидобактерий и лактобацилл, иммобилизованных на цеолите – энтеросорбенте; и «Бактериостатин» (Крафт, Россия) – метабиотик, содержащий метаболиты Bacillus subtilis, цеолитовый носитель, гидролизат соевой муки и стеарат кальция. К сожалению, производители не предоставляют подробных характеристик препаратов, сроки годности не всегда совпадают с заявленными, а их эффективность не доказана в рамках масштабных исследований. Обзор использования цеолитов и цеолитсодержащих пород показывает, что степень иммобилизации бактерий не коррелирует с содержанием клиноптилолита, катионообменной емкостью или дзета-потенциалом и не может быть предсказана на основе минералогического и химического анализа, поэтому каждый минеральный образец, содержащий различные типы цеолита, является кандидатом на использование в качестве носителя бактерий при условии, что он нетоксичен. Это означает, что новые пробиотические препараты, созданные на минеральных носителях, должны обладать полной комплексной характеристикой, а польза от их применения должна быть подтверждена в экспериментах, в том числе и на организме человека. Известно, что усвоение питательных веществ ограничено тонким кишечником. Обилие иммунных клеток в этом анатомическом месте в сочетании с уменьшением секреции слизи и более рыхлыми спайками (отчасти для более эффективного всасывания жидкости и питательных веществ) также приводит к тесному взаимодействию хозяина и микроорганизмов, несмотря на более быстрый транзит. В связи с этим раннее высвобождение пробиотиков из капсульных форм не обеспечивает нужного перехода лиофилизированных бактерий в вегетативные формы, что и обуславливает поиск носителей, обладающих способностью к постепенному выходу целевых биоагентов на всем протяжении продвижения препаратов по желудочно-кишечному тракту. Кроме того, такие носители могут обеспечить и сохранность целевых свойств терапевтических белков, в качестве которого был выбран фермент РНКаза, обладающий известным противоопухолевым потенциалом. В настоящей работе мы разработали ряд новых комбинаций пробиотических лактобактерий на минеральном носителе, которые остаются стабильными, сохраняют пробиотические свойства при длительном хранении и высвобождаются постепенно, обеспечивая целевую активность пробиотиков в организме при пероральном приеме. Представлена подробная характеристика клиноптилолит-содержащей породы Татарско-Шатрашанского месторождения, подобраны параметры ее оптимальной гранулярности (до 60 мкм) для адсорбции лактобацилл, а также показано, что размеры пор, объединенных в полости, достаточны для размещения в них не только молекул белка, но и бактерий. Отобрано пять известных пробиотических штаммов лактобактерий, которые загружены в клиноптилолит-содержащую породу разной степени гранулярности: № 1 (до 40 мкм), № 2 (40-60 мкм) и № 3 (0.2-0.8 мм). Было установлено, что иммобилизация на минеральном носителе с диаметром частиц до 60 мкм включительно приводит к полноте связывания во всех случаях более 93 %, тогда как для образца № 3 этот показатель был значительно меньше. Использование лиопротекторной сукрозно-желатино-молочной среды после иммобилизации способствовало высокому уровню выживаемости и продукции органических кислот в течение 8 месяцев хранения. Перспективные результаты были получены при инкубации препаратов в желудочном и кишечном соках. Степень устойчивости всех штаммов к желудочному стрессу по стандартным критериям [Pinto et al., 2006] оценивается как «хорошая»; устойчивость к кишечному стрессу отмечена как «очень хорошая», что свидетельствует о том, что микрогранулированные носители в препаратах поддерживают потенциал устойчивости лактобацилл. Высвобождение бактерий из носителя происходит постепенно в течение 12 часов, что доказывает, что пробиотики при пероральном приеме будут активны, когда достигнут верхних отделов кишечника. Также разработан новый органоминеральный комплекс, сочетающий противоопухолевую активность фермента РНКазы и детоксикационную активность минерального носителя для последующего использования в фармакологии. Подобраны условия обработки носителя клиноптилолита, минерала группы цеолитов. Высокотемпературная и спиртовая обработка приводят к деалюминизации клиноптилолита, освобождению его от остаточной органики и уменьшению количества микропор диаметром менее 10 мкм. Приготовленный таким образом клиноптилолит адсорбирует более 70% противоопухолевой РНКазы из раствора за 3 часа. Динамика высвобождения РНКазы из носителя показала, что фермент постепенно высвобождается в течение 20 часов. Этого времени вполне достаточно для целевого действия противоопухолевого фермента в желудочно-кишечном тракте. Особое значение имеет результат, полученный in vitro на модельных желудочном и кишечном соках, подтверждающий сохранение каталитической активности фермента в течение 20 часов, поскольку деградация РНК является ключевым фактором противоопухолевой активности РНКазы. Таким образом, сочетание детоксифицирующей активности клиноптилолита и противоопухолевой активности РНКазы позволяет рассматривать полученный препарат не только как фактор неспецифической защиты организма, но и как перспективный противоопухолевый препарат, дополняющий известные химиотерапевтические средства, применяемые при лечении новообразований желудочно-кишечного тракта. Безопасность носителей подтверждена отсутствием токсичности в отношении клеток аденокарциномы легких человека A549 и клеток эмбрионального эпителия легких коровы LEK. Таким образом, микрогранулированная клиноптилолит-содержащая порода имеет высокий потенциал для практического применения в качестве перспективного минерального носителя пробиотических бактерий и терапевтических белков. Дальнейшее исследование оздоравливающих свойств созданных препаратов будет проведено на животных, а в перспективе при получении положительных результатов и на людях.

Публикации

1. Ильинская О., Галеева А., Глухов М., Курди У., Зеленихин П., Колпаков А., Яковлева Г., Лопатин О. New design and characteristics of probiotics immobilized on 2 clinoptilolite-containing tuff Scientia Phrnaceutica, Sci. Pharm. 2024, 92, x. https://doi.org/10.3390/xxxxx (год публикации - 2024)
10.3390/scipharm92030046

2. Ильинская О.Н., Галеева А.Г., Яковлева Г.Ю., Глухов М.С., Колпаков А.И., Лопатин О.Н. ОРГАНОМИНЕРАЛЬНЫЙ ПРЕПАРАТ ПРОБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ Вопросы питания, Вопросы питания. 2024. Т. 93. № 3 (553). С. 77-78 (год публикации - 2024)
10.33029/0042-8833-2024-93-3s-019

3. Салихжанова А.Ф., Ягафорова А.И., Яковлева О.В. The use of fluorouracil to create an acute irritable bowel syndrome model on mice Book of Abstracts. Dolgoprudny: MIPT, Moscow, 2024. – 256 p., Сборник тезисов международной конференции «BIOMEMBRANES 2024» 07.10.2024-11.10.2024. (год публикации - 2024)

4. Ольга Ильинская, Галина Яковлева, Павел Зеленихин, Алексей Колпаков, Уильям Курди, Михаил Глухов, Игорь Седов и Сергей Харинцев Novel Organomineral Complex with Prolonged Antitumor Action International Journal of Molecular Sciences, Int. J. Mol. Sci. 2025, 26, 9205 (год публикации - 2025)
10.3390/ijms26189205

5. Н.С. Карамова, О.Н. Ильинская Антимутагенный потенциал четырех штаммов бактерий рода Lactobacillus Экологическая генетика, Экологическая генетика. 2025. Т. 23. № 2. С. 155–161. (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.17816/ecogen676907

6. Ольга Ильинская, Михаил Глухов, Галина Яковлева, Антонина Галеева, Уильям Курди Ribonuclease A-Mineral Carrier Complex as a Potential Antitumor Preparation European Journal of Biology, European Journal of Biology, EJB 2025, 84 (1): 62–71 (год публикации - 2025)
10.26650/EurJBiol.2025.1609925

7. Глухов М.С., Галеева А.Г., Яковлева Г.Ю., Колпаков А.И., Лопатин О.Н., Ильинская О.Н. Комплекс минерального сорбента с противоопухолевой РНКазой [Электронный ресурс 1 файл: 0,8 Мб]: Казань, 3–4 февраля 2025 г.– Казань: Казанский (Приволжский) федеральный университет,, Сборник тезисов региональной научно-практической микробиологической конференции, посвященной 90-летию со дня рождения И.Б. Лещинской [Электронный ресурс 1 файл: 0,8 Мб]: Казань, 3–4 февраля 2025 г.– Казань: Казанский (Приволжский) федеральный университет, 2025, с.17-19 (год публикации - 2025)

8. Ильинская О.Н., Курди У., Вагин К.С., Яковлева Г.Ю., Глухов М.С., Колпаков А.И., Лопатин О.Н Органоминеральный комплекс с пробиотической и детоксицирующей активностью для восстановления микробиома кишечника Материалы XIII ежегодной Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием «Микробиология в современной медицине» Казань, 20 июня 2025г., «Казанский Государственный Медицинский Университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Материалы XIII ежегодной Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Микробиология в современной медицине» Казань, 20 июня 2025г., «Казанский Государственный Медицинский Университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, с.48-50 (год публикации - 2025)

9. Карамова Н.с., Ильинская О.Н. Антимутагенная активность штамма Lactobacillus plantarum В578 Сборник тезисов региональной научно-практической микробиологической конференции, посвященной 90-летию со дня рождения И.Б. Лещинской [Электронный ресурс 1 файл: 0,8 Мб]: Казань, 3–4 февраля 2025 г.– Казань: Казанский (Приволжский) федеральный университет, Сборник тезисов региональной научно-практической микробиологической конференции, посвященной 90-летию со дня рождения И.Б. Лещинской [Электронный ресурс 1 файл: 0,8 Мб]: Казань, 3–4 февраля 2025 г.– Казань: Казанский (Приволжский) федеральный университет, 2025, с.29-30 (год публикации - 2025)

10. Карамова Н.С., Курди У., Яковлева Г.Ю., Фуфыгина Е.А., Харитонова М.А., Зеленихин П.В., Глухов М.С., Колпаков А.И. , Ильинская О.Н. Анализ безопасности минерального сорбента для элиминации патогенных бактерий Материалы XIII ежегодной Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием «Микробиология в современной медицине» Казань, 20 июня 2025г., «Казанский Государственный Медицинский Университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Материалы XIII ежегодной Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием «Микробиология в современной медицине» Казань, 20 июня 2025г., «Казанский Государственный Медицинский Университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, с.52-53 (год публикации - 2025)

11. Вагин К.С., Курди У., Яковлева Г.Ю., Колпаков А.И., Ильинская О.Н. Пробиотики на минеральном наноносителе для восстановления после лучевой терапии. 5-й Российский микробиологический конгресс : сборник тезисов докладов ; Волгоград, 29 сентября – 3 октября 2025 г. / под ред. Д. А. Бабкова. – Волгоград : Библиотечно- издательский центр ВолгГМУ, 2025, 5-й Российский микробиологический конгресс : сборник тезисов докладов ; Волгоград, 29 сентября – 3 октября 2025 г. / под ред. Д. А. Бабкова. – Волгоград : Библиотечно- издательский центр ВолгГМУ, 2025, с. 252-253 (год публикации - 2025)

12. Яковлева О.В., Салихзянова А.Ф., Ягафарова А.И Влияние цеолитов на поведенческие реакции мышей при введении 5-фторурацила VIII МЕЖДУНАРОДНЫЙ КОНГРЕСС, ПОСВЯЩЕННЫЙ А. Ф. САМОЙЛОВУ, "ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЯ. АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ МЕДИЦИНЫ". СБОРНИК ТЕЗИСОВ. Российский кардиологический журнал. 2025; 30(13S), VIII МЕЖДУНАРОДНЫЙ КОНГРЕСС, ПОСВЯЩЕННЫЙ А. Ф. САМОЙЛОВУ, "ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЯ. АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ МЕДИЦИНЫ". СБОРНИК ТЕЗИСОВ. Российский кардиологический журнал. 2025; 30(13S), с.57-58 (год публикации - 2025)
10.15829/1560-4071-2025-13S

13. Ильинская О.Н., Карамова Н.С., Шайдуллов И.Ф., Колпаков А.И., Яковлева Г.Ю., Ситдикова Г.Ф. Effect of antitumor ribonuclease a and binase on micronucleus induction and intestinal contractility in experimental mice Biological communication, Biological communication, v.3, 2025 (год публикации - 2025)

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Органоминеральные комплексы, содержащие целевые агенты – пробиотические бактерии, либо противоопухолевые РНКазы животного и бактериального происхождения, сорбированные на минеральном носителе, созданы как лабораторные образцы для испытаний на безопасность и функциональность. Установлено, что этапная обработка природной клиноптилолит-содержащей породы приводит к улучшению сорбционных свойств носителя. Трибомеханическая обработка применялась для получения микрогранулярной фракции носителя, которая затем подвергалась высокотемпературному прокаливанию и промывке этанолом для элиминации остаточной органики и увеличению количества мезо- и макропор, эквивалентный диаметр которых позволяет включать бактерии и белки. Определены параметры загрузки и выгрузки целевых агентов, показано, что препараты сохраняют функциональную активность в течение 10 месяцев хранения. При этом зарегистрирован поэтапный выход пробиотиков, либо РНКаз из носителя в течение 20 ч, что и было основным требованием при создании препарата пролонгированного действия, отличающего его от капсульных форм имеющихся на рынке препаратов. Оценка возможного токсического действия органоминеральных комплексов показала отсутствие токсичности как самих комплексов, так и минеральных носителей и их экстрактов по отношению к грамположительным и грамотрицательным кишечным бактериям, а также к микромицетам рода Candida. Не выявлено токсических эффектов препаратов по отношению к нормальным и онкотрансформированным эпителиальным клеткам кишечника Hutu 80 и Caco-2.Важные результаты получены при анализе генотоксичности, которая является обычным следствием химио- и радиотерапии рака. Выявлено, что комплексы не обладают мутагенностью в краткосрочных тест-системах (тест Эймса по реверсии ауксотрофных штаммов Salmonella typhimurium прототрофности) и в микроядерном тесте in vivo, результаты которого подтверждают отсутствие кластогенного и анеугенного эффектов при пероральном приеме комплекса лабораторными животными. Более того, установлено, что лактобациллы, входящие в органоминеральный комплекс, обладают антимутагенной активностью. Суспензия живых клеток и супернатант культуральной жидкости штамма L. plantarum В578 вызывают подавление мутагенного эффекта тестерных химических соединений, как в экспоненциальной, так и стационарной фазе роста бактерий. Антимутагенный эффект в отношении азида натрия и 2-нитрофлуорена составил от 18.9 % до 45.6 % и от 25.0 % до 43.5 % соответственно. Таким образом, полученные данные свидетельствуют не только об отсутствии токсичности и генотоксичности органоминерального комплекса с лактобациллами, но и о вкладе последних в детоксикацию химических мутагенов, к которым относится большинство химиотерапевтических агентов. Проведены эксперименты на лабораторных животных, модулирующие условную лучевую терапию и химиотерапию, с целью выявить возможность восстановления кишечного микробиома после дисбиоза, спровоцированного терапией. У мышей, подвергшихся облучению, зарегистрировано значительное нарушение микробиома, что выразилось в снижении в 3.4 раза операционных таксономических единиц филума Bacteroidota, увеличении в 1.6 раза – филума Bacillota и в 8.0 раз – филума Pseudomonadota; последнее служит важным индикатором дисбиоза, свидетельствующим о воспалительном процессе. На уровне филума Bacillota по сравнению с контролем прием препарата увеличивает количество Ruminococcaceae и Peptostreptococcaceae, которые значимо снижены при облучении (вплоть до полной элиминации Peptostreptococcaceae), а также увеличивает содержание Lactobacillaceae. Возросшее при облучении содержание Clostridiaceae и Butyricicoccaceae после приема препарата восстанавливается до контрольного уровня в фекалиях необлученных животных. Восстанавливающим эффектом обладает и сам носитель, что подтверждает его детоксицирующее действие, известное для многих цеолитов. Для бычьей РНКазы А и бактериальной РНКазы Bacillus pumilus (биназы) на минеральном носителе показана сохранность каталитической активности в жидкостях желудочно-кишечного тракта и поэтапный выход ферментов в течение 20 ч. Установлено, что инкубация препарата толстой кишки мышей с биназой и с РНКазой А не приводит к изменениям спонтанной и вызванной карбахолином сокращений, что указывает на отсутствие прямого эффекта РНКаз как непосредственно на гладкомышечные клетки, так и нейрональные компоненты регуляции перистальтики и соответственно, ферменты не будут индуцировать один из самых частых побочных эффектов лучевой и химиотерапий – диарею, связанную с усилением перистальтики. Результаты проделанной работы по созданию перспективного противоопухолевого препарата на минеральном носителе привлекли внимание средствах массовой информации, что привело к освещению их в популярной форме в интернете, в сайтах масс-медиа Казанского федерального университета (https://media.kpfu.ru/news/v-kfu-sozdali-protivoopukholevyy-preparat-na-osnove-umnogo-minerala-dobyvaemogo-v-tatarstane) и Минобр науки РФ (https://minobrnauki.gov.ru/press-center/news/nauka/98381/).

Публикации