Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проект направлен на продолжение разработки принципиально нового класса терапевтических средств для разрушения внутриклеточного белка, необходимого для размножения коронавируса SARS-CoV-2, а именно, исследование эффектов разрабатываемых конструкций на животной модели. На данном (первом) этапе проекта целью является создание in vivo модели заболевания коронавирусной инфекцией путем трансфекции легких мышей геном N-белка SARS-CoV-2 для последующей проверки эффективности созданных конструкций для его направленной элиминации. Для достижения данной цели необходимо было подобрать и оптимизировать как систему доставки генетического материала в клетки, так и метод эффективного и хорошо воспроизводимого введения раствора для трансфекции непосредственно в легкие животных. Для осуществления трансфекции in vivo мы выбрали невирусный способ доставки ДНК с помощью полиплексов, наночастиц, образованных поликатионом и плазмидной ДНК, несущей последовательность N-белка под эукариотическим промотором. Осуществлен подбор оптимальных условий получения полиплексов с плазмидой с N-белком, слитым с mRuby3: путем анализа девяти вариантов полиплексов по распределению по размеру и эффективности трансфекции клеток в культуре найдены оптимальные соотношения компонентов для получения наилучшей трансфекции. Для осуществления инстилляции раствора полиплексов в легкие животных было осуществлено сравнение двух активно применяемых методов: непосредственно внутритрахеальное введение и метод орофарингеальной аспирации. Основываясь на экспериментальных данных по эффективности, воспроизводимости и переносимости животными для дальнейшей работы был выбран метод орофарингеальной аспирации, который обеспечивал 100% эффективное введение раствора в легкие с хорошей воспроизводимостью, достаточно гомогенное распределение в легких, а также хорошую переносимость животными данной процедуры. В соответствии с подобранными условиями была осуществлена трансфекция плазмидами, кодирующими как целевой (на основе N-белка коронавируса SARS-CoV-2), так и репортерный флуоресцентный (turboYFP) белки. Двумя независимыми способами (иммуноблоттинг гомогенатов тканей и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия срезов легких) показана экспрессия продуктов доставляемых полиплексами генов (как целевого N-белка, так и репортерного флуоресцентного белка turboYFP). Также методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии показана принципиальная возможность детекции трансфекции лёгких на животной модели. Путем анализа интенсивности флуоресценции полученных изображений показано статистически достоверное увеличение на 40% регистрируемого флуоресцентного сигнала в канале turboYFP в опытных срезах по сравнению с контрольными. Таким образом, цель данного этапа проекта была достигнута: создана in vivo модель заболевания коронавирусной инфекцией путем трансфекции легких мышей геном N-белка SARS-CoV-2. По результатам работ данного этапа опубликовано/принято в печать 4 статьи, одна из них входит в Q1.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Проект направлен на продолжение разработки принципиально нового класса средств для индуцируемой деградации внутриклеточного белка, необходимого для размножения коронавируса SARS-CoV-2. Проведенные коллективом в течение последних лет исследования показали принципиальную возможность снижения уровня нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2 (N-белка) в клетках в культуре за счет оригинальных белковых конструкций на основе модульных нанотранспортеров (МНТ), несущих новые модули для взаимодействия с N-белком, привлечения убиквитинлигазы E3 и контролируемого расщепления эндосомальной протеазой. Целью настоящего проекта является исследование эффектов разрабатываемых конструкций на животной модели. Для достижения данной цели в 2024 году на первом этапе проекта была разработана in vivo модель заболевания коронавирусной инфекцией путем трансфекции легких мышей геном N-белка SARS-CoV-2 для последующей проверки эффективности созданных конструкций для его направленной элиминации. Основной целью этапа проекта этого года являлось исследование взаимодействия промежуточных конструкций типов I (состоящей из монободи к N-белку коронавирусов, и пептида, проникающего в клетку) и II (состоящей из монободи к N-белку коронавирусов, лиганда к интернализуемому рецептору и компонента для выхода из эндосом) с N-белком коронавируса SARS-CoV-2 в клетках легких с временной экспрессией N-белка на животной модели. Данные конструкции должны лечь в основу создания конечного варианта МНТ (конструкция типа III), содержащего модуль для деградации N-белка. Для достижения поставленной цели были наработаны, очищены и охарактеризованы конструкции типа I и II (МНТ-I и МНТ-II) в количествах, достаточных для проведения всех последующих запланированных экспериментов in vivo. Для осуществления эффективной доставки полученных МНТ в клетки легких с временной экспрессией N-белка коронавируса SARS-CoV-2 на животной модели необходимо было подобрать и оптимизировать метод введения рекомбинантных белков в легкие. На основе анализа литературных данных мы выбрали компрессорный небулайзер (Microlife NEB 210), обеспечивающий создание аэрозоля со средним размером микрокапель 2 мкм, что представляется оптимальным для решаемых задач. Было показано сохранение целостности МНТ после небулизации. Методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии срезов легких была показана эффективность доставки МНТ in vivo с использованием выбранной модели небулайзера. Используемая в работе по проекту in vivo модель заболевания коронавирусной инфекцией основана на временной трансфекции клеток легких мышей полиплексами - наночастицами, образованными поликатионом и плазмидной ДНК, несущей последовательность N-белка под эукариотическим промотором. Для осуществления дальнейшей запланированной по проекту работы было наработано, очищено и охарактеризовано достаточное количество плазмидной ДНК, несущей ген N-белка коронавируса SARS-CoV-2, слитый с геном флуоресцентного белка mRuby3 (далее, N-protein-mRuby3). Полученного количества было достаточно для проведения всех последующих экспериментов по изучению взаимодействия конструкций типов I и II с N-белком коронавируса SARS-CoV-2 в клетках легких с временной экспрессией N-белка in vivo. Методом клеточного анализа теплового сдвига (CETSA) показано, что после ингаляции МНТ-I проникает в ткани легкого мыши и взаимодействует с экспрессирующимся в клетках легких N-белком. Для МНТ-II заметного образования комплекса с N-белком не зарегистрировано, что может быть связано как с недостаточным количеством или недостаточной доступностью рецепторов, так и с ограничениями метода CETSA, не позволяющими обнаружить относительно небольшие концентрации МНТ в клетках. На основании полученных данных для следующего этапа проекта по деградации N-белка предпочтительнее использовать конструкцию типа III (МНТ-IIIa), основанную на типе I. Однако, для осуществления более обоснованного выбора, представляется оптимальным сравнить МНТ-IIIa с конструкцией типа II (МНТ-IIIb), так как даже небольшие концентрации МНТ-III могут приводить к деградации белка при насыщении убиквитинлигазы. В рамках работы данного этапа опубликован обзор Sobolev A. S., Georgiev G. P. Innovative Strategies for the Targeted Degradation of Viral Proteins: Paving the Way for Next-Generation Therapeutics //Pharmaceutics. – 2025. – Т. 17. – №. 11. – С. 1420 (Q1 по WoS), в котором анализируется разработка и применение стратегий целенаправленной деградации белков для противовирусной терапии, такие как технология PROteolysis-TArgeting Chimeras (PROTAC) и технология исполнителей настоящего проекта, основанная на применении МНТ, несущих антителомиметик, узнающий белок-мишень, и модуль с пептидом, связывающим убиквитинлигазу Е3, для последующей деградации белка-мишени. Таким образом, цель данного этапа проекта была достигнута: было изучено взаимодействие исследуемых на данном этапе конструкций (МНТ-I и МНТ-II) с N-белком коронавируса SARS-CoV-2 в клетках легких с временной экспрессией N-белка, найден предпочтительный тип конструкции для создания конструкции типа III, включающей модуль для деградации N-белка.