Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проведена серия экспериментов по задержке в геле ДНК-белковых комплексов в присутствии сахаров, которые могут быть эффекторами YihW и cAMP-CRP и влиять на силу связывания этих регуляторов с двумя межгенными участками, yihU/V и yihV/W, из двух штаммов кишечной палочки, отличающихся кассетой yih-генов – Escherichia coli K12 MG1655 (длинный вариант) и Escherichia coli Nissle 1917 (короткий вариант). Показано, что оба белка эффективно связываются с исследуемыми участками, причем их связывание регулируется только лактозой и сульфохиновозой (SQ); глюкоза и галактоза влияния не оказывают. Связывание CRP в присутствии SQ зависело от межгенной области: SQ усиливала связывание CRP c yihV/W и ослабляла связывание с yihU/V. В E. coli Nissle 1917 лактоза не влияла на связывание CRP, а в штамме с кассетой K-12 MG1655 усиливала связывание с участком yihU/V и ослабляла с yihV/W. Это означает, что на связывание CRP с ДНК может влиять не только cAMP, но и другие эффекторы. Поэтому на следующем этапе исследование этих комплексов будет продолжено с помощью плазмонного резонанса. YihW из К-12 также хорошо связывается с обоими фрагментами. Добавление SQ усиливало связывание YihW с межгенными участками yihV/U и yihV/W как длинной, так и короткой кассеты. Добавление лактозы имело противоположный эффект, причем сильнее оно влияло на связывание YihW у Nissle 1917. В дальнейшем будет проведен аналогичный эксперимент с YihW из Nissle 1917. В настоящее время уже получено и отсеквенировано два варианта экспрессионных конструкций на основе плазмиды pGEMEX. На следующем этапе будут оценены константы связывания белков с ДНК в присутствии обоих эффекторов, а также кинетика образования комплексов с помощью плазмонного резонанса. С помощью gene doctoring получен штамм Nissle 1917 с делетированным геном lacZ и оценен его рост на различных сахарах в сравнении со штаммом дикого типа. На глюкозе рост статистически не отличался от штамма дикого типа и от штамма К-12 MG1655. На лактозе Nissle 1917 рос хуже K-12 MG1655, а его мутант по lacZ был способен к медленному росту в присутствии лактозы – рост был даже лучше, чем зарегистрированный ранее для штамма К-12 dlacZ. Таким образом, для Nissle 1917 лактоза является менее предпочтительным субстратом, чем для К-12, но при этом он способен медленно ее утилизировать в отсутствие основной бета-галактозидазы. В присутствии SQ Nissle 1917 рос плохо, и разницы в скорости роста мутантного штамма и штамма дикого типа не было. Тем самым, в отличие от К-12, короткая кассета Nissle 1917 практически не способна к метаболизму SQ. Было изучено семейство факторов транскрипции CsoR. Были построены выравнивания и филогенетические деревья; разрешены соотношения ортологичности; определены мотивы в ДНК, узнаваемые этими факторами; определены новые кандидаты исследуемых регулонов. На следующем этапе аналогичный анализ будет проведен для семейств MntR и CopY. Исследованы фазовые вариации в локусах использования полисахаридов (Polysaccharide Utilization Locus) у бактероидов. Такие локусы включают гены susCD, кодирующие транспортеры внешней мембраны, и ген рекомбиназы. За счет инверсий, производимых этой рекомбиназой, происходит подстановка участка, содержащего промотор и N-конец гена susC, к различным копиям этого гена. В результате в каждый момент в локусе работает один оперон susCD, а выбор работающего оперона изменяется случайным образом. Показано, что в штаммах Bacteroides thetaiotaomicron имеются четыре варианта локуса PUL, порождаемых инверсиями по повтору, и восстановлена эволюционная история локуса. В геномах Bacteroides идентифицированы вторые локусы PUL с другой рекомбиназой. Построены ортологические ряды транспортеров susCD и описан состав локусов PUL у бактероидов. Планируется более подробно изучить эволюцию этих локусов, а также начать анализ подробный других случаев фазовых вариаций. Построен набор перекрывающихся генов бактерий, произведена кластеризация ортологичных пар, фильтрация и уточнение данных, классифицированы типы перекрываний. Показано, что (а) в кластерах с частыми перекрываниями события происходят быстро и параллельно, (б) в кластерах с редкими перекрываниями применение стандартного метода реконструкции состояний на внутренних узлах BayesTraits приводит к вычислительным артефактам. Работа продолжается. Начато исследование эволюции межгенных промежутков штаммов Escherichia coli. Было показано, число полиморфизмов в сайтах связывания транскрипционных факторов часто равно нулю, а в остальных случаях на порядок меньше количества полиморфизмов вне сайта. Для каждого фактора была оценена консервативность его сайтов; оказалось, что сайты факторов, связанных с sigma-54, консервативнее сайтов факторов, связанных с другими сигма-факторами. Гены 23 малых РНК, за единственным исключением (gcvB) не имели полиморфизмов. На следующем этапе планируется исследование полиморфизмов в промоторах и терминаторах и написание статьи. Начато изучено распределение бактерий с гигантскими геномами: проведена фильтрация данных, определены и приоритизированы таксоны для дальнейшей работы. По двум критериям – гомологии оперонов parAB и количеству общих генов – установлены соответствия между репликонами 22 бактерий из рода Azospirillum. Независимо полученные результаты демонстрируют хорошее соответствие. Геномы распадаются на две ветви, внутри которых соответствия устанавливаются надежно; для соответствий между ветвями требуется более подробный анализ. Результаты доложены на международных конференциях: • Evolution of complexity and statistical physics, Ереван; • Bioinformatics of Genome Regulation and Structure / Systems Biology, BGRS/SB-2024, Новосибирск; • Геномика, метагеномика и молекулярная биология микроорганизмов, Сколтех. Совместно с РНФ в Сколтехе проведено мероприятие «Наука без турникетов». Участниками проекта прочитано 12 популярных лекций по теме геномики и эволюции бактерий в Москве, Долгопрудном, Пущино, Дубне, Сыктывкаре, Тбилиси, Самаре, Сочи (Сириус).

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Исследована эволюция геномов Myxococcota. Построены ортологические ряды, филогенетические деревья, филетические паттерны. Ортологические ряды с большим числом паралогов содержат гены, кодирующие регуляторные белки (факторы транскрипции, двукомпонентные системы, белки с доменами PAS и CHASE, TonB рецепторы, серин-треониновые протеин-киназы — 12 из 20 самых больших рядов, из них четыре самых больших), а также белки, связанные с взаимодействием и подавлением других организмов (пять рядов: поликетид-синтазы, нерибосомные пептид-синтазы, система секреции VI типа, цитохромы Р450, белки с доменом DNRLRE). Это хорошо согласуется с известным наблюдением, что доля регуляторных генов растет с увеличением бактериального генома, а также указывает, что Myxococcota могут служить источником новых антибиотиков. Исследовано 22 полных генома Azospirillum spp., состоящих из 6–10 репликонов. Разработана методика отождествления репликонов на основе состава генов и филогении белков сегрегации ParAB. Показано, что однокопийные критические гены находятся в основном на самом большом репликоне (хромосоме), реже на втором по размеру и почти никогда — на более мелких. Предсказаны точки начала репликации и сайты связывания фактора инициации репликации DnaA, сайты ParS, с которыми связываются белки сегрегации ParAB, мотивы dif, состоящие из сайтов связывания рекомбиназ XerC и XerD, участвующие в сегрегации реплицированных димеров. В ряде репликонов предсказаны новые регуляторные мотивы, образующие кластеры в области начала репликации. В Bacteroides spp. описана новая система фазовой вариации, в которой выбор функционального транспортера из кассеты susCD происходит за счет инверсии фрагмента, расположенного в центре кассеты и содержащего промотор и 5’-терминальную область гена susC. Инвертируемый фрагмент содержит также ген рекомбиназы, а гены susC – сайты в кодирующей области, по которым происходит рекомбинация. Гены susCD, образующие локус, образуют несколько подсемейств, причем их состав быстро варьирует даже в близкородственных штаммах. Создан вектор для суперпродукции транскрипционного фактора YihW (CsqR) из пробиотического штамма Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) и подобраны оптимальные условия для его синтеза в гомологичной экспрессионной системе; разработан оптимизированный протокол очистки YihW. Это потребовало существенной молификации стандартных протоколов. YihW из E. coli Nissle 1917 и K-12 MG1655 образовывали высокомолекулярные комплексы со своими ДНК-мишенями, возможно, за счёт олигомеризации белков. SQ вызывала диссоциацию этих комплексов, подтверждая свое эффекторное действие. При 30°C YihW из Nissle 1917 взаимодействовал с yihU/V из родительского штамма и E. coli K-12 MG1655 с одинаковой эффективностью, но при 37°C связывание с фрагментом K-12 было сильнее. YihW из E. coli K-12 MG1655 связывал всю ДНК yihU/V при 16-кратном молярном избытке независимо от штамма, что позволяет предположить, что в Nissle 1917 YihW в меньшей степени участвует в регуляции yih-кассеты по сравнению с K-12, особенно при 37°C. Похожие эффекты наблюдались и для межгенного участка yihV/W. По-видимому, связывание регулятора с регуляторной областью собственного гена (авторегуляция) может быть изначально слабее или контролироваться более строго. Влияние SQ на диссоциацию комплекса между YihW из Nissle 1917 и обоими межгенными фрагментами родительского штамма было ниже, чем с фрагментами из K-12. В совокупности с результатами РНК-секвенирования, которое показало отсутствие активации yih-кассеты Nissle 1917 при росте в присутствии SQ, это позволяет предположить, что yih-кассета и YihW в Nissle 1917 могут выполнять иную функцию, нежели поддержание метаболизма сульфохиновозы. Определены мотивы связывания MntR в альфа- и гамма-протеобактериях и в микобактериях. Новыми членами регулона являются оперон синтеза гликогена glgBXCAP в гамма-протеобактериях (Mn2+-зависимая регуляция синтеза гикогена была ранее описана у стрептококков), Mn2+-зависимая каталаза, транспортер CirA, оперон, кодирующий оксидазу и транспортер двухвалентных катионов, и ген с неизвестной функцией, кодирующий белок с доменами ферритин-редуктазы и связывания двухвалентных катионов. В семействе CsoR определены три подсемейства, содержащие никель-кобальтовые регуляторы. Мотивы связывания факторов имеют характерную структуру с АТ-богатыми палиндромными флангами и GC-богатой серединой; большинство с типичным для семейства CsoR консенсусом ATA-N11-TAT. Определены гены, регулируемые этими факторами. Большинство членов регулонов — транспортеры ионов, причем как экспортеры, так и импортеры. Кроме того, в состав регулонов входят: никель-зависимые ферменты, в особенности участвующие в метаболизме азота (уреазы UreC, фактор связывания уреазы HypB, Ni-связывающие ГТФазы, субъединицы нитрогеназы NifC и NifD, цистеиновая десульфураза NifH); ферменты синтеза кобаламина (CobW, CbiX, GlcG/HbpS); S-аденозил-метионин-зависимые метилазы из различных семейств; металлоферменты (гидролазы, металлопептидазы); белки метаболизма железа и железо-серных кластеров; белки защиты от меди и хрома; факторы транскрипции (в т.ч. зависящие от железа, меди и цинка). Это указывает на глубокие связи систем гомеостаза различных металлов. Исследованы полиморфизмы в промоторах и терминаторах Escherichia coli. Боксы в промоторах как сигма-70, так и других сигма-факторов (28, 32, 38) существенно консервативнее соседних позиций; большинство промоторов вообще не имело полиморфизмов в боксах. Показана консервативность терминаторов, как ро-независимых, так и ро-зависимых.