Аннотация результатов, полученных в 2024 году
1-2) Получен оптимальный на данный момент протокол синтеза и очистки пегилированных дикарбоновых кислот (FABPEG) по результатам сравнения четырёх протоколов. Показано, что наибольший выход реализуется в случае синтеза в одну стадию в диметилформамиде (ДМФА) в 10 кратном избытке диизопропилкарбодиимид (ДИК) и 1.1 кратном избытке N-ПЕГов и N-гидроксисукцинимида (NHS). Полученный протокол позволяет получать соединения, пригодные для получения липидных кубических фаз с расширенными водными каналами. Предметом дальнейшей оптимизизации остаётся проблема неполного разделения моно- и ди-ПЕГ-илированной карбоновой кислоты. На данный момент нами были синтезированы препараты FABPEG в достаточных количествах для проведения тестовых измерений с трёхкомпонентными системами и кристаллизационных экспериментов. 3) Методом малоуглового рассеяния было изучено влияние длины гидрофильной части полимера, способа синтеза и очистки FABPEG, порядка смешивания компонентов и способа гомогенизации смеси на параметры расширенных липидных мезофаз. Согласно полученным результатам, длина гидрофильной части существенным образом влияет на тип мезофазы и размеры водных каналов. При использовании FABPEG с молекулярным весом PEG в ~2500 и ~5000 Да достигаются расширенные ЛКФ с диаметрами водного канала до ~190 Å и ~240 Å, соответственно, однако для последнего диапазон условий устойчивости ЛКФ ограничен. Дальнейшее увеличение количества звеньев PEG не позволяет получить расширенные ЛКФ, а приводит к образованию либо расширенной ламеллярной фазы, либо нерасширенной кубической. Результаты выполнения соответствующего пункта плана-графика на первый год выполнения проекта были представлены на Всероссийской конференции с международным участием «БИОХИМИЯ ЧЕЛОВЕКА», г. Москва, Россия, 17-19 октября 2024. Рижиков Ю.Л., приглашённый устный доклад: «МАЛОУГЛОВОЕ РАССЕЯНИЕ В ИССЛЕДОВАНИЯХ СТРУКТУРЫ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ И МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕОБРАЗОВАНИЙ В ЛИПИДНЫХ СИСТЕМАХ ДЛЯ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ». Ссылка на официальный сайт конференции: https://innovativedrugs.ru/berezov2024/. Ссылка на сборник тезисов (ISBN 978-5-906023-40-7): https://www.innovativedrugs.ru/berezov2024/биохимия-человека-тезисы-2024.pdf. Было проведено сравнение измерений методом малоуглового рентгеновского рассеяния образцов в ПЦР-пробирках и в боросиликантых капиллярах. Продемонстрирован вклад в кривую рассеяния от ПЦР-пробирок, который не может быть корректно учтён при обработке данных, однако показано, что в случае измерений липидной кубической фазы он не препятствует корректной идентификации типа симметрии и параметров решётки. Результаты этих методических экспериментов, проведённых с белковым препаратом ферритина из H. pylory, рекомбинантно экспрессированного в E. coli, обеспечили предварительные данные в исследовании стехиометрии гибридных глобул ферритина, внеся вклад в работу M.S. Gette, et. al, “Ferritin-based hybrid macromolecules experience unusual shift of stoichiometry distribution”, которая была подана в журнал International Journal of Biological Macromolecules. 4) Подготовлены генетические конструкции для экспрессии белков DesK, MscS, CusA, ClyA, AcrB, MsbA и YojI. Проведены эксперименты по тестовой экспрессии, приемлемые выходы белка получены для DesK, MscS, ClyA, MsbA и YojI. Отработаны протоколы очистки целевых белков DesK, MscS, ClyA, MsbA и YojI. Для белка DesK предложен оптимизированный протокол экспрессии, позволяющий получить значительную долю белка в связанном с АТФ/АДФ состоянии. Результаты исследования влияния условий экспрессии DesK на получение аденозиндифосфат-связанных состояний, полученные при выполнении пункта №5 плана-графика работ на первый год выполнения проекта, были представлены на международной конференции «Biomembranes'24», г. Долгопрудный, Россия, 7-11 октября 2024. Kuklina D.D., Ryzhykau Yu.L., постерный доклад: «Expression temperature influence on adenosine phosphate-bound state of recombinant BsDesK». Ссылка на официальный сайт конференции: https://biomembranes.events/. Ссылка на сборник тезисов: https://disk.yandex.ru/d/8zHHvPUJt9qZ0g. По этим результатам был подготовлен манускрипт D.D. Kuklina, et. al., “Expression temperature influence on adenosine phosphate-bound state of recombinant BsDesK”, поданный в журнал Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. 5) В экспериментах по коэкспресии белков NpSRII и NpHtrII был получен избыток белка трансдюсера - NpHtrII по отношению к сенсорному родопсину NpSRII. Выход NpHtrII составил ~2 мг с литра культуры. Так как именно этот белок в составе комплекса имеет большую водорастворимую часть (~30-35 нм), он является подходящей мишенью для дальнейших экспериментов по кристаллизации в мезофазах с расширенными водными каналами. 6) Был проведён сравнительный анализ распределений разрешения известных структур мембранных белков от таких параметров белка как его максимальный диаметр, размер гидрофильной части белка вдоль нормали к мембране и молекулярный вес, который показал, что ограничение по диаметру водного канала ЛКФ является “бутылочным горлышком” in meso кристаллизации. Результаты этого сравнительного анализа были представлены на международной конференции «Biomembranes'24», г. Долгопрудный, Россия, 7-11 октября 2024. Zhuravlev S.A., Kazantsev A.S., Ivaschenko S.D., Kuklina D.D., Ryzhykau Y.L., постерный доклад: «Comparative analysis of high-resolution structures of membrane proteins». Ссылка на официальный сайт конференции: https://biomembranes.events/. Ссылка на сборник тезисов: https://disk.yandex.ru/d/8zHHvPUJt9qZ0g. По этим результатам подготовлен манускрипт S.A. Zhuravlev, et.al., “Comparative analysis of high-resolution structures of membrane proteins”, поданный в журнал Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В 2025 году в рамках проекта, направленного на развитие методов ‘in meso’-кристаллизации крупных мембранных белков, получены следующие результаты: 1. Синтез FABPEG. Оптимизирована двухстадийная очистка FABPEG-5k (гель-фильтрация + перекристаллизация), подобраны условия, позволяющие существенно снизить долю монопегилированной примеси. 2. Липидные мезофазы с детергентами и FABPEG. С помощью малоуглового рентгеновского рассеяния построены карты фазовых состояний систем моноолеин-FABPEG-вода и моноолеин/монопальмитин-лаурилсаркозинат-вода. Показано, что добавление FABPEG и ионогенных ПАВ позволяет получать расширенные кубические фазы с увеличенным диаметром водных каналов и управлять переходами между кубическими и ламеллярными фазами. Обнаружены расширенные гексагональные фазы с очень широкими водными каналами (>200 Å), рассматриваемые как потенциальный новый тип матрицы для кристаллизации крупных мембранных белков. 3. Выбор и подготовка новых белков-мишеней. Была пересмотрена стратегия подбора тестовых мишеней; в силу достаточности ранее отобранного набора α-спиральных мембранных белков, расширение списка за счёт MetNI, QFR, PBP1b признано нецелесообразным. В качестве новой мишени выбран β-бочкообразный белок наружной мембраны E. coli CsgG с крупным периплазматическим доменом; сконструированы экспрессионные плазмиды на основе pET27_bmod, отработаны протоколы экспрессии и выделения белка. 4. CsgG: экспрессия и скрининг детергентов. Подобраны условия экспрессии CsgG в штамме BL21(DE3). Предложен многоступенчатый протокол «вычитающей» солюбилизации наружной мембраны (OPOE → LS → FOS-CHOLINE) для селективного извлечения CsgG при сильном снижении уровня фоновых белков. 5. Генно-инженерные конструкции NpHtrII. Получены генно-инженерные конструкции полноразмерного NpHtrII и укроченных вариантов: HtrII(1–137) и HtrII(1–213). 6. Препаративная экспрессия и очистка модельных мембранных белков Для BsDesK подтверждена воспроизводимость протоколов экспрессии, солюбилизации и очистки; получены препараты олигомеров, пригодных для кристаллизации. Для HtrII(1-213) показано, что он преимущественно находится в растворимой фракции и в результате очистки не даёт гетерогенный препарат. Сделан вывод о непригодности NpHtrII как тестовой мембранной мишени. Для MsbA отработаны условия экспрессии, солюбилизации в лаурилсаркозинате и Ni-аффинной очистки; получена в основном димерная форма белка. Для YojI показано преимущество лаурилсаркозината по сравнению с DDM; получен гомогенный белок после металл-хелатной и гель-фильтрационной хроматографии. Для ClyA получен гомогенный белок после металл-хелатной хроматографии. Для MscS установлено, что протеолиз остаётся критической проблемой и препятствует дальнейшему масштабированию. 7. SAXS-исследования FABPEG и мембран с MsbA. Предложена и реализована методика оценки степени дипегилирования FABPEG по интенсивности рассеяния в нулевой угол. На комбинации солюбилизационных тестов и SAXS показано, что рекомбинантный MsbA при оверэкспрессии преимущественно локализуется во внешней мембране E. coli и вызывает измеримые изменения её толщины и структуры. 8. ‘In meso’-кристаллизация модельных белков. Подготовлены и протестированы серии кристаллизационных матриксов на основе FABPEG-2k/5k/10k и кубических фаз моноолеина/монопальмитина для белков DesK, ClyA, MsbA и YojI, включая NMB подход для MsbA. Получены кристалло-подобные образования для нескольких белков; проведены первичные дифракционные эксперименты (ESRF, SSRF), показавшие, что в протестированных условиях наблюдаемая дифракция обусловлена солью и липидами; намечены направления дальнейшей оптимизации. 9. Биоинформатический и структурный анализ мембранных белков. Выполнен биоинформатический поиск гибридных родопсин–гистидин-киназ зелёных водорослей, классифицированы их доменные архитектуры, продемонстрирована перспективность этого класса белков для оптогенетики и кристаллизации в ЛКФ. Проведён сравнительный анализ баз OPM и RCSB, показавший растущую доминирующую роль крио-ЭМ в структурной биологии эукариотических и человеческих мембранных белков. Переработан алгоритм оценки гидрофильной толщины мембранных белков и заново посчитана статистика для структур, полученных методами ‘in meso’ и ‘in surfo’; новые распределения согласуются с физическими ограничениями по диаметру водных каналов липидных кубических фаз. По результатам выполнения работ за 2024-2025 гг. в 2025 году были сделаны доклады на всероссийских и международных конференциях: 1) Рижиков Ю.Л. и др. II школа молодых ученых «Современные вызовы молекулярной биологии», г. Шерегеш, Россия, 30.03-04.04 2025 г. Приглашенный доклад “Структурный анализ мембранных белков: малоугловое рассеяние и кристаллизация”. Сборник тезисов: https://disk.yandex.ru/i/Q5Yq0R5fR8EEIA 2) С. А. Журавлёв и др. 67-ая конф. МФТИ, г. Долгопрудный, Россия, 31.03-05.04 2025 г. Стендовый доклад “Сравнительный анализ распределения структур мембранных белков по гидрофобной толщине”. Ссылка на сборник тезисов: https://old.mipt.ru/upload/medialibrary/f85/2_-lfi_2025.pdf 3) О. В. Семкин и др. 67-ая конф. МФТИ, г. Долгопрудный, Россия, 31.03-05.04 2025 г. Стендовый доклад “Определение локализации рекомбинантно экспрессированных мембранных белков в мембранах E. coli”. Сборник тезисов: https://old.mipt.ru/upload/medialibrary/f85/2_-lfi_2025.pdf 4) А. Ю. Шишкин и др. 67-ая конф. МФТИ, г. Долгопрудный, Россия, 31.03-05.04 2025 г. Устный доклад “Исследование условий образования и диапазонов устойчивости расширенных липидных кубических фаз”. Сборник тезисов: https://old.mipt.ru/upload/medialibrary/f85/2_-lfi_2025.pdf 5) Журавлёв С.А. и др. 5th RUSSIAN INTERNATIONAL CONFERENCE ON CRYO-ELECTRON MICROSCOPY 2025, г. Москва, Россия, 8-11.06.2025 г. Стендовый доклад "CRYO-ELECTRON MICROSCOPY OF MEMBRANE PROTEINS: QUANTITY CHAMPION, QUALITY CHALLENGER?" Сборник тезисов: https://www.bioeng.ru/riccem/wp-content/uploads/sites/2/2025/11/tezisy-riccem-2025.pdf 6) Шишкин А. Ю. и др. 29th International Scientific Conference of Young Scientists and Specialists (AYSS-2025), г. Дубна, Россия, 27-31.10.2025. Стендовый доклад “Possibilities of obtaining swollen lipid cubic phases using various ionogenic surfactants.” Ссылка на тезисы: https://indico.jinr.ru/event/5517/contributions/33374/ 7) Безручко И. О. и др. AYSS-2025, г. Дубна, Россия, 27-31.10. 2025. Стендовый доклад Effective production of E. coli ABC-transporter MsbA for in meso crystallization improvement. Ссылка на тезисы: https://indico.jinr.ru/event/5517/contributions/33375/ 8) Журавлёв С.А. и др. AYSS-2025, г. Дубна, Россия, 27-31.10.2025 г. Стендовый доклад "Improved Analysis of the Hydrophilic Dimensions of Membrane Proteins from X-ray Crystallographic Data " Ссылка на тезисы: https://indico.jinr.ru/event/5517/contributions/33373/