Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Один из наиболее перспективных подходов иммунотерапии опухолей -комбинированная терапия. Всё чаще используют комбинацию ингибиторов контрольных точек иммунитета и антител против эпидермального фактора роста, комбинацию нескольких ингибиторов контрольных точек иммунитета [Lu et.al., 2022], проходят клинические испытания онколитических вирусов в комбинации с другими иммунотерапевтическими препаратами [Zou et.al., 2023]. Онколитические вирусы обладают несомненным преимуществом, поскольку в геном вируса можно встроить гены, кодирующие иммуностимулирующие агенты [Nguyen et.al.,2020]. Ген CSF2 человека - один из распространенных трансгенов при конструировании рекомбинантных онколитиков. Продукт этого гена, цитокин ГМ-КСФ, используют в иммунотерапии опухолей [Hong-My et.al., 2020], однако по последним данным, ГМ-КСФ – «обоюдоострый» препарат, и его применение может приводить к прогрессированию опухоли [Anil et.al., 2022]. Сами онколитические вирусы также могут влиять на иммунное микроокружение опухоли, как усиливая иммунный ответ, так и активируя иммуносупрессию [Junfeng et.al., 2023]. Разработанный нами онколитический вирус осповакцины VV-GMCSF-Lact несет трансген ГМ-КСФ человека, и для понимания механизма действия VV-GMCSF-Lact необходимы исследования вклада ГМ-КСФ в противоопухолевую эффективность вирусного препарата, а также влияния вируса на иммунное микроокружение опухоли. Одной из проблем терапии глиом является расположение опухоли в пределах черепной коробки и часто в жизненно важных областях мозга, что накладывает ограничения при разработке методов терапии глиом. Формирование отека и воспаления в процессе лизиса опухолевых клеток при виротерапии может снижать качество жизни пациентов. Таким образом, необходимо подобрать оптимальную дозу VV-GMCSF-Lact для применения препарата для терапии опухолей внутричерепной локализации. При выполнении этапа 1 проекта (2024 г.) проведены следующие работы и получены результаты: 1. Анализ уровней экспрессии и секреции ГМ-КСФ клетками глиом человека и глиомы GL261 мыши в условиях инфекции VV-GMCSF-Lact в культуре показал, что при воздействии на клетки глиом человека и мыши онколитическим вирусом повышается уровень экспрессии гена GMCSF человека. При этом, в клетках глиомы мыши экспрессия гена GMCSF ниже, чем в клетках человека, и клетки глиомы мыши не секретируют человеческий ГМ-КСФ во внеклеточное пространство. 2. При исследовании вклада ГМ-КСФ, экспрессируемого VV-GMCSF-Lact в инфицированных клетках, в противоопухолевую эффективность вируса с использованием глиомы GL261 мыши, подкожно трансплантированной мышам линии C57Bl/6, показано, что структурные изменения в опухоли (выраженность стромального компонента, исходная митотическая активность), а также особенности действия препарата (противоопухолевая эффективность, выраженность и характер деструкции, влияние на митотическую активность опухоли) зависит от пола мышей. 3. При анализе изменений иммунного статуса мышей с подкожно трансплантированной глиомой GL261 при терапии VV-GMCSF-Lact или рекомбинантными ГМ-КСФ (человеческим или мышиным) в режиме монотерапии по изменениям состава популяций клеток иммунной системы в органах и тканях мышей-опухоленосителей, показано, что онколитический вирус индуцирует активацию противоопухолевого иммунного ответа вне зависимости от пола животного, но существуют различия в вовлечении в иммунный ответ конкретных компонентов иммунной системы у животных разного пола: у самок уменьшается количество иммуносупрессивных Т-регуляторных клеток опухоли, а у самцов в опухоли уменьшается количество М2-макрофагов и увеличивается количество Т-клеток. 4. Получены препараты суммарной РНК опухолей подкожно трансплантированной мышам глиомы GL261 и сконструированы NGS кДНК-библиотеки. При секвенировании полученных кДНК-библиотек на платформе FastaSeq300 (GeneMind) установлено, что инфицирование опухолей VV-GMCSF-Lact сопровождается активацией транскрипционных факторов (ТФ) семейства NFKB1, STAT1, CEBPA/B и повышением уровней мРНК интерлейкинов (IL6, IL1B, IL1RN), хемокинов (CXCL1,-2,-5,13), интерферона IFNB1 и др. Инфекция вирусом приводит к подавлению активности ТФ SOX9/10, снижению уровней коллагенов COL2A1, COL11A2, подавлению интегринового сигналинга и других процессов, связанных с клеточными взаимодействиями. При ответе клеток на инфекцию происходит подавлением процессов эпителиально-мезенхимального перехода опухолевых клеток и снижение экспрессии генов, характерных для глиобластом пронейрального субтипа. Инъекции hGMCSF в опухоль GL261 приводит к активации ТФ семейства p53 (TP53, TRP53, TRP63), а также MYC, BRC1,что сопровождается повышением уровней мРНК про-митотического циклина CCNB1, регулятора митоза MKI67, кератинов KRT5,-14,-17, а также белков кератиноцитов SPRR1A,-B. Происходит снижение активности ТФ семейства NFKB1, STAT1, подавление иммунного ответа, контролируемого NFKB1/RELA, STAT1. То есть, при действии hGMCSF в опухоли GL261 подавляется ряд ключевых процессов, активируемых VV-GMCSF-Lact. Мета-анализ с привлечением данных архива NCBI SRA позволил установить, что инфекция VV-GMCSF-Lact вызывает снижение вклада клеток глиомы GL261 в трансплантированных опухолях и изменяет вклады клеток опухолевого микроокружения. Инъекции GMCSF в опухоль вызывают лишь минорные изменения вклада макрофагов и NK-клеток и не приводит к снижению вклада клеток глиомы GL261. 5. При подборе оптимального дозового режима интратуморального применения VV-GMCSF-Lact при терапии ортотопически трансплантированных глиом GL261 мыши и С6 крысы, показано, что доза вируса ≥107 БОЕ/животное приводит к проявлению токсических эффектов терапии. Введение VV-GMCSF-Lact в более низких дозах вызывает значительное снижение митотической активности клеток глиомы GL261. При введении вируса в дозе 6×106 БОЕ/мышь наблюдается тенденция к увеличению продолжительности жизни животных.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Иммунотерапия опухолей, в том числе терапия ингибиторами иммунных контрольных точек (ИКТ) и виротерапия, - одни из наиболее активно развивающихся в настоящее время противоопухолевых подходов. Неоспоримым преимуществом иммунотерапевтических подходов является возможность их применения как в комбинации с любыми другими методами лечения опухолей, так и в комбинации друг с другом. Ранее в ряде исследований была показана эффективность терапии глиом комбинацией онколитических вирусов и ингибиторов контрольных иммунных точек. При терапии глиомы GL261, трансплантированной мышам линии C57Bl/6В, вирусом кори и антителами к PD-1 был показан синергический эффект комбинации препаратов на выживаемость экспериментальных животных по сравнению с монотерапией вирусом или anti-PD-1. После терапии в мозге мышей увеличивалось количество Т-клеток, при этом в опухолевой ткани детектировали наличие воспалительного процесса [1]. В работе Янга и соавт. на модели иммунокомпетентной глиомы показано, что комбинация онколитического полиовируса PVSRIPO и ингибиторов PD-1/PD-L1 оказывает влияние на микроокружение опухоли - опухоль-ассоциированные макрофаги и микроглию, и обуславливает активацию микроглии, ингибирование роста опухоли и длительную ремиссиям заболевания у экспериментальных животных [2]. К настоящему моменту эффективность совместного применения онколитических вирусов и ингибиторов контрольных точек иммунитета показана в основном в доклинических исследованиях на животных моделях, клинические исследования таких комбинаций пока весьма малочисленны. Например, были проведены клинические исследования фазы II комбинации аденовируса DNX-2401 и ИКТ пембролизумаба при рецидивирующей глиобластоме, но результаты этих исследований пока не опубликованы (NCT02798406). Поскольку подобные иммунотерапевтические схемы пока не одобрены к применению в клинике, и часто иммунотерапия сопровождается псевдопрогрессией опухоли из-за формирования отека при рекрутинге иммунных клеток, необходимы тщательные доклинические исследования комбинированного подхода с применением ИКТ и онколитических вирусов. При выполнении второго этапа проекта (2025 год) проведены следующие работы и получены результаты: 1. Показано, что противоопухолевая эффективность комбинации онколитического вируса VV-GMCSF-Lact и моноклональных антител к PD-1 при терапии глиомы GL261, подкожно-трансплантированной иммунокомпетентным мышам, выше, чем эффективность каждого из препаратов как для самцов (ТРО = 91,9%), так и для самок (ТРО = 82,7% и 76,7%, доза вируса в комбинации 2,5×106 БОЕ/мышь и 1×107 БОЕ/мышь, соответственно). Гистологический анализ опухолей подтверждает данные о противоопухолевой эффективности комбинированной терапии: вне зависимости от дозы вирусного препарата, количество митозов клеток опухолевой ткани при лечении комбинацией препаратов достоверно снижается по сравнению с контрольной и anti-PD-1 группами. 2. При анализе изменений иммунного статуса мышей с подкожно трансплантированной глиомой GL261 при лечении вирусом VV-GMCSF-Lact или антителами к PD-1 в режиме монотерапии, а также при комбинированной терапии вирусом и антителами, показано, что терапия опухоли комбинацией препаратов способна уменьшать влияние иммуносупрессивного микроокружения опухоли и нивелировать недостатки монотерапии каждым из исследуемых препаратов. При этом иммунотерапевтическое действие комбинации препаратов реализуется по разным механизмам, в зависимости от пола животного. 3. Проведен NGS-анализ РНК глиом GL261, подкожно трансплантированных иммунокомпетентным мышам линии С57BI/6, при терапии опухоли онколитическим вирусом VV-GMCSF-Lact, нейтрализующими антителами к PD1-рецептору мыши (anti-PD1) и их комбинацией. Установлено, что изменения транскриптомов опухолей GL261 при терапии онколитическим вирусом VV-GMCSF-Lact существенно отличаются от таковых при терапии нейтрализующими антителами к PD1. Оценка изменений вклада клеток различного происхождения в опухоль методом деконволюции позволяет заключить, что при терапии опухоли вирусом и комбинацией вируса и антител к PD1 происходит снижение вклада в опухоль клеток глиомы GL261, TDEC и Treg-клеток; при терапии опухоли антителами к PD1 и комбинацией онколитического вируса и антител к PD-1 в опухоли повышается вклад опухоль-ассоциированных фибробластов. Детальный анализ NGS-данных позволил выявить общие, однонаправленные изменения транскриптомов злокачественных опухолей, часть из которых позволяет говорить о синергическом действии вируса и A'PD1-антител. Комбинированная терапия A'PD1 + VV-GMCSF-Lact наиболее полно активирует процессы противоопухолевого иммунного ответа. Комбинированная терапия активирует процессы врожденного иммунного ответа модулируя сигнальные пути cGAS-STING и TLR, что приводит к экспрессии ключевых цитокинов (Ifng, Tnf, Il-1b и Il-6) и хемокинов, активирующих моноциты (Ccl3, Ccl4), нейтрофилы (Cxcl1, -2, -5) и макрофаги (M-csf). Таким образом, терапия опухоли комбинацией онколитического вируса VV-GMCSF-Lact и A'PD1-антител может нивелировать недостатки терапии вирусом или A'PD1 иммуноглобулинами в режиме монотерапии, формируя многокомпонентный иммунный ответ, направленный против опухоли. 4. В сотрудничестве с командой нейроонкологов НМИЦ им. ак. Е.Н. Мешалкина разработана методика клинического применения VV-GMCSF-Lact для терапии пациентов с рецидивами глиом высокой степени злокачественности, предусматривающая введение вирусного препарата в стенки резекционного ложа непосредственно после удаления основного объема опухоли. Разработаны проект Протокола клинического исследования I/II фазы безопасности, переносимости и эффективности лекарственного препарата на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины у пациентов с рецидивом глиом высокой степени злокачественности при неэффективности стандартных методов лечения» и проект Информированного согласия пациентов для участия в исследовании (см. Приложение к Отчету). Разработанные документы станут основой регистрационного досье для получения разрешения Минздрава РФ на проведение апробации методики применения вирусного препарата для терапии глиом. После получения разрешения Минздрава РФ протокол клинического исследования будет согласован с локальным этическим комитетом ФГБУ "НМИЦ им. ак. Е.Н. Мешалкина" Минздрава России. 1. Hardcastle J. и др. Immunovirotherapy with measles virus strains in combination with anti–PD-1 antibody blockade enhances antitumor activity in glioblastoma treatment // NEUONC. 2016. С. now179. 2. Yang Y. и др. Polio virotherapy targets the malignant glioma myeloid infiltrate with diffuse microglia activation engulfing the CNS // Neuro-Oncology. 2023. Т. 25, № 9. С. 1631–1643.