Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В ходе выполнения первого этапа проекта получен обширный набор данных, сочетающий как результаты влияния нейромодуляторов человека на различные процессы в нейронах и астроцитах, так и данные по фармакологии нейромодуляторов, а также результаты структурных исследований по взаимодействию Ly6 белков с нейрональными никотиновыми рецепторами. Результаты проекта опубликованы в виде 2х статей Q1 в ведущих международных журналах (Cell Dearth Discovery (Nature group) и Molecular Neurobiology) и представлены на разных международных и отечественных конференциях. Биоинформатический анализ выявил изменение экспрессии генов трехпетельных белков и никотиновых рецепторов ацетилхолина в разных областях мозга при развитии болезни Альцгеймера (БА). Наиболее ярким было уменьшение LYNX1 в коре мозга, гиппокампе, и веретенообразной извилине. Экспрессия CHRNA7 увеличивалась в коре и падала в гиппокампе и веретенообразной извилине. Получены миллиграммовые количества рекомбинантных аналогов водорастворимых доменов Lynx1 (ws-Lynx1), Lypd6 (ws-Lypd6), Lypd6b (ws-Lypd6b) и PSCA (ws-PSCA). Токсичный амилоидный пептид Аβ(1-42) уменьшал число дендритных шипиков в нейронах гиппокампа. Напротив, ws-Lynx1 увеличивал число дендритных шипиков в нейронах, но не отменял негативный эффект Аβ(1-42). Ws-Lypd6 и ws-Lypd6b с Аβ(1-42) снижали количество дендритных шипиков в нейронах. Ws-PSCA не влиял на число дендритных шипиков сам по себе, но вместе с Аβ(1-42) сокращал число шипиков. Аβ(1-42) уменьшал площадь, периметр астроцитов и приводил к их «вытягиванию», а нетоксичный амилоид Аβ(42-1) уменьшал периметр и также приводил к «вытягиванию» астроцитов. ws-Lynx1 уменьшал периметр астроцитов, вместе с Аβ(1-42) уменьшал площадь клеток, увеличивал их периметр и приводил к «вытягиванию» астроцитов. Трехпетельные белки как сами по себе, так и с Аβ по-разному влияли на морфологию астроцитов, функциональное значение этих эффектов предстоит выяснить. На втором этапе проекта исследование будет продолжено. В нейронах гиппокампа Аβ не влиял на активность AKT, ERK, JNK и р38. Ws-Lypd6b и ws-PSCA активировали АКТ, совместная инкубация нейронов с ws-Lypd6b и ws-PSCA и Аβ активировала АКТ по сравнению с Аβ. Ws-Lypd6 не влиял на активность АКТ в нейронах, но при совместном применении с Аβ усиливал активность этой киназы. Ws-Lynx1 не влиял на АКТ сам по себе и с Аβ. Ws-Lynx1 активировал ERK в нейронах, а Аβ(1-42) отменял данный эффект. Ws- Lypd6, ws-Lypd6b и ws-PSCA не влияли на активность ERK сами по себе и при совместном применении с амилоидами. Ws-Lynx1 сам и с Аβ не влиял на активность JNK. Ws-Lypd6, ws-Lypd6b и ws-PSCA сами по себе и с Аβ уменьшали активность JNK. Все белковые препараты и Аβ не влияли на активность р38 МАР киназы в нейронах. Влияния белков и Аβ на активность исследуемых киназ в астроцитах обнаружено не было. На втором этапе проекта исследование будет продолжено. В нейронах Аβ(1-42) приводил к интернализации α7, α3 и α4 субъединиц nAChR внутрь клеток. Препараты белков совместно с Аβ(1-42) вызывали падение экспрессии α7-nAChR по сравнению с действиями нейромодуляторов. Аβ(1-42) уменьшал экспрессию α3-nAChR и α4-nAChR, а ws-Lypd6b - α3-nAChR в нейронах. В астроцитах гиппокампа, как препараты белков и Аβ не влияюли на экспрессию nAChR, но, Аβ(1-42) приводил к интернализации α7, α3 и α4 субъединиц nAChR внутрь клеток. Совместное применение ws-Lynx1, ws-Lypd6 и ws-Lypd6b с Аβ(1-42) приводило к сильному падению экспрессии в астроцитах α7- и α4- nAChR. Ws-PSCA как сам по себе, так и при применении с Аβ увеличивал экспрессию α3-nAChR в астроцитах. Обнаружено, что возможной мишенью PSCA является α4β2 HS (высокочувствительная стехиометрическая форма рецептора, содержит 2 α-субьединицы и 3 β-субъединицы), но не α4β2 LS, α4β4 и α3β2. Воздействие PSCA было обратимым и не влияло на кинетику работы каналов. На втором этапе проекта исследование будет продолжено. Ws-Lypd6b продемонстрировал широкий спектр активности в отношении α7, α3β2 и α4β2. Наиболее выраженное ингибирование наблюдалось для α7 и α4β2-HS nAChR. Методом ЯМР-спектроскопии было проведено комплексное исследование структуры и динамики белка PSCA. PSCA имеет характерную для трехпетельных белков бета-структурную организацию с петлевыми участками. В структуре присутствует два бета-листа: один в первой петле, второй включает остатки из петли II и III. В петле I присутствует одиночный виток 3-10-спирали. β-Структурная организация молекулы PSCA стабилизирована сетью водородных связей, характерных для β-слоев, а также рядом дополнительных. Для некоторых участков (Ala35-Leu36 и Cys50-Lys61) наблюдалась значительная степень неупорядоченности. Анализ молекулярного гидрофобного потенциала не выявил выраженных амфифильных свойств молекулы, а также значительной кластеризации: гидрофобные и полярные группы равномерно распределены по поверхности PSCA. Для комплекса Lynx-1–α7-nAChR предложено две моды связывания: ортостерическая (с участием основного сайта, опосредующие остатки рецептора – L60, W77, Y115, W171 и Y210) и аллостерическая (где взаимодействие происходит главным образом по внешней плоскости C-петли рецептора, опосредующий остаток рецептора – K204). Мутация K204A во внеклеточном домене а7-nAChR приводила к существенному ухудшению ингибирующей активности при сохранении активности рецептора, что позволило выбрать в качестве финальной модели комплекс с аллостерической модой взаимодействия нейромодулятор/рецептор. Для комплекса PSCA–α4β2-nAChR было получено три ансамбля решений. Большинство взаимодействий PSCA и интерфейса β2–β2 приходится на остатки первой петли и (+)-субъединицу; большой вклад вносит остаток K7 пептида. Взаимодействие между PSCA и α4–β2 происходит в основном по второй петле и (−)-субъединице. В симметричном интерфейсе β2–α4 PSCA взаимодействует с (+)-субъединицей первой и второй петлей. На втором этапе проекта исследование будет продолжено с целью выявления однозначного сайта взаимодействия и построения финальной модели комплекса. Для уточнения ранее полученной модели Lypd6/a7-nAChR, было проведено исследование взаимодействия мутантов нейромодулятора с точечными заменами с рецептором. Однако, ни одна из мутаций не ослабляла взаимодействие, кроме R17A и W18A, для которых наблюдалось усиление ингибирования рецептора. Результаты объясняются либо стерическими ограничениями взаимодействия «мутант-рецептор», либо другой мишенью действия Lypd6 – например, корецептор Wnt Lrp6. На втором этапе проекта исследование будет продолжено. Кроме того, был получен ряд незапланированных результатов. Было выявлено, что повышение уровня холинергических модуляторов Lypd6 и Lypd6b характерно для аутизма и приводит к тревожности и снижению когнитивных функций. Выявлено, что ws-Lynx1 повышает плотность дендритных шипиков в нейронах и стимулирует формирование астроцитарной сети и сигнальные пути в астроцитах.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
1. ПЦР в реальном времени показала, что ни препараты амилоида, ни трехпетельные белки не влияли на экспрессию мРНК JNK и ее вторичного мессенджера с-Jun. Нейротоксичный олигомеризованный амилоид Aβ1-42 снижал уровень мРНК c-Fos в нейронах гиппокампа, но Lynx1 и Lypd6b возвращали экспрессию c-Fos к контрольным уровням. Не обнаружено влияния амилоидов и белков на экспрессию мРНК CREB1. Вестерн-блоттинг выявил падение уровня пре-синаптического маркера синапсина под действием нетоксичного обратного амилоида Аβ42-1 и Lypd6b и при совместном действии Аβ42-1 с Lynx1, Lypd6 и PSCA. Lypd6 и PSCA снижали экспрессию синапсина при совместном действии и с токсичным амилоидом Аβ1-42. Аβ1-42 уменьшал экспрессию синаптофизина 1, трехпетельные белки не влияли на экспрессию синаптофизина и не отменяли эффекта Аβ1-42. Вещества не влияли на экспрессию PSD95 и GluR1, Lypd6b с Aβ1-42 увеличивали уровень α1 субъединицы GABAA рецептора. Вещества не влияли на уровень экспрессии рецептора Wnt Frizzled 4, Lypd6 и Lypd6b понижали (хотя и незначимо) уровень транскрипционного фактора β-катенина в нейронах гиппокампа. Таким образом, трехпетельные белки могут регулировать некоторые эффекты Аβ1-42: отменять их (отмена ингибирования экспрессии c-Fos), либо усиливать (влияние Lypd6b и амилоида на белковый уровень GABAAR α1). При этом, трехпетельные белки не влияют на некоторые эффекты Аβ1-42 (ингибирование экспрессии синаптофизина). 2. Для следующих типов nAChR: высокочувствительные (HS) (α4)2(β2)3, низкочувствительные (LS) (α4)3(β2)2, α4β4 и α7. Для α4β2/α3β2-nAChR наблюдалось дозо-зависимое ингибирование PSCA с IC50 15±50 мкМ и максимальным снижением амплитуды токов на 30% от контроля. Отсутствие ингибирующего эффекта для α4β4-nAChR указывает на то, что одной из мишеней PSCA может быть β2-субъединица. Также дозо-зависимый и обратимый ингибирующий эффект наблюдался для α7-nAChR, максимальный ингибирующий эффект составлял 63% от контроля, а IC50 не отличалось от IC50 для β2-содержащих рецепторов. Возможно, в нервной системе одной из основных мишеней могут быть α7β2 рецепторы. Были получены мутантные варианты PSCA, и показано, что мутации D15A и K45A усиливали ингибирующую активность, а мутация D53A ослабляла активность PSCA. Таким образом, PSCA ингибирует α4β2, и α7, но не α4β4-nAChR. Для ингибирования α7-nAChR важен аспартат в петле III (D53). 3. Lypd6 значимо снижал активность сигнального пути Wnt, Lypd6b также ингибировал Wnt-сигнализацию. Два мутантных варианта Lypd6 с заменами R17 и N42 значимо отменяли ингибирующую активность Lypd6, эффект остальных мутаций не достигал уровня статистической значимости. Итак, Lypd6 и Lypd6b ингибируют сигнальный путь Wnt, и ингибирующий эффект Lypd6 опосредован петлевыми участками молекулы – петлей I (остаток R17) и петлей II (остаток N42). 4. Проведен дизайн миметиков Lynx1 с целью усилить их про-когнитивные свойства. Пептиды были получены методом химического синтеза, их чистота подтверждена ВЭЖХ и масс-спектроскопией. 5. Исследовано влияние Lynx1 на поведение мышей моделирующих БА (Tg+), данные сравнили с нормальными мышами (Tg-). Тест открытое поле не выявил отличий в поведении Tg- и Tg+ мышей, а также Tg+ мышей после 10-дневного интраназального введения Lynx1 в незнакомой среде. Было обнаружено, что некоторые Tg+ мыши движутся в открытом поле быстрее, чем контрольные Tg-, а терапия Lynx1 возвращала подвижность мышей к норме. В тесте на формирование условного рефлекса пассивного избегания (удар током в темной камере) время задержки перед входом в темную часть камеры значительно возрастает у Tg- мышей (мышь задерживается в светлой камере, помня об опасности в темной). У Tg+ мышей рост задержки незначителен, а у Tg+ мышей, получающих Lynx1 условный рефлекс формируется у большего числа мышей, чем даже у Tg- (не у ~ 30%, а у ~ 70%). Тест на обучение «лабиринт Барнса» (животное ищет «норку» в поле) показал, что к 5му дню теста в контрольной группе только одна мышь (~ 10%) не смогла найти норку к концу сессии, а в группе Tg+ таких мышей было более половины (~ 54%). Терапия Lynx1 улучшала обучение Tg+ мышей (норку не находили ~ 33% мышей). Тест на обонятельную память, при котором животное обнюхивало бумажку с запахом неизвестной мыши показал, что Tg- мыши на 2й день нюхают бумажку с запахом неизвестной мыши значительно меньше, чем в 1й, так как запах уже знаком, но Tg+ мыши обнюхивают запах одинаково долго и в первый и во второй день. Терапия Lynx1 возвращает время обнюхивания к норме. Не обнаружено отличий между Tg- и Tg+ в тесте на моторную память ротарод. Таким образом, Lynx1 в некоторых тестах оказывает про-когнитивный эффект при БА, однако этот эффект может быть усилен при использовании миметика белка. 6. Системная терапия Lynx1 не приводит к изменениям ни в кратковременной ни в долговременной моделях синаптической пластичности у группы Tg+ по сравнению с группой, получавшей Lynx1. 7. Биоинформатический анализ экспрессии генов трехпетельных белков в разных областях мозга (Human Protein Atlas) показал, что во всех частях мозга человека в наибольшей степени экспрессированы мРНК, кодирующие следующие белки: GPIHBP, CD59, Ly6E, Ly6H, Lynx1, Lynx2. Экспрессия Lypd6, Lypd6b и PSCA в норме в мозге была незначительна (примерно на 2-3 порядка ниже, чем LYNX1 и LYNX2). 8. Проведен анализ изменений экспрессии мРНК трехпетельных белков при различных неврологических нарушениях по данным базы данных Gene expression Omnibus и показали, что экспрессия мРНК многих трехпетельных белков меняется при БА. В целом, экспрессия LY6/UPAR незначительно изменяется при легкой форме болезни Альцгеймера, в то время как экспрессия PSCA, SPACA4, TEXT101, LY6G6E, LY6D, LY6E, LYPD3, LYPD6B, LYPD8, PATE2 и PATE4 значительно повышается в различных областях мозга при тяжелой форме БА. Экспрессия GML, PINLYP, CD59, LYPD6, Ly6H, SLURP1 и PATE1 снижается в различных частях мозга при тяжелой форме БА. Некоторые из генов (GPHBP1, CD177, LYNX1, LYNX2, LYPD4, LYPD5) могут повышаться в определенных областях мозга и понижаться в других. Например, экспрессия GPIHBP1 и CD177 повышена в энторинальной коре и понижена в височной коре; LYNX1 повышен в энторинальной, височной и лобной коре и понижен в мозжечке; LYNX2 и LYPD5 повышены в лобной коре и понижены в височной коре; LYPD4 имеет пониженную экспрессию в энторинальной коре и повышенную в лобной коре. В целом, нами обнаружены изменения экспрессии генов трехпетельных белков при многих неврологических расстройствах, характеризующихся дисфункцией nAChR. 9. Проведен анализ влияния белков PSCA и Lynx2 на секрецию факторов воспаления и адгезии нейронами и астроцитами. PSCA увеличивал секрецию VCAM-1 TNFβ и снижал секрецию EpCAM и E-селектина нейронами. Инкубация с PSCA повышала секрецию E-селектина и TNFβ астроцитами; но снижала секрецию ими провоспалительного цитокина IL12 p40. Lynx2 приводил к увеличению секреции нейронами VCAM-1. Итак, трехпетельные белки регулируют секрецию факторов воспаления и молекул адгезии нейронами и астроцитами.