Микроглия и макрофаги циркумвентрикулярных структур головного мозга - ключевые участники патогенеза нейровоспаления

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-15-00032

НазваниеМикроглия и макрофаги циркумвентрикулярных структур головного мозга - ключевые участники патогенеза нейровоспаления

Руководитель Коржевский Дмитрий Эдуардович, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" , г Санкт-Петербург

Конкурс №92 - Конкурс 2024 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-106 - Нейробиология

Ключевые слова Микроглия, Макрофаги, Головной мозг, циркумвентрикулярные структуры, нейровоспаление, иммуногистохимия, конфокальная микроскопия, биологические модели заболеваний, нейродегенерация

Код ГРНТИ76.03.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Проект направлен на решение проблемы регуляции проявлений нейровоспаления, изучения его роли в патогенезе нейродегенеративных заболеваний, а также поиска новых способов предотвращения нейродегенерации, основанных на модуляции активности микроглиоцитов и макрофагов. Основным моментом, определяющим актуальность решения указанной проблемы, является общепризнанный факт высокой социальной значимости нейродегенеративных заболеваний, что обусловлено их широкой распространенностью, высокой степенью инвалидизации пациентов и отсутствием удовлетворительных методов лечения и профилактики. Для изучения проявлений нейровоспаления и его взаимосвязи с нейродегенерацией предлагается использовать новые экспериментальные модели и новые объекты, ранее мало исследовавшиеся в экспериментах по индукции нейровоспаления - субфорникальный орган (СФО) и субэпендимные области (СЭО) боковых и III желудочков головного мозга крыс линий SHR и Вистар. Субфорникальный орган является важным регулятором водно-солевого обмена и энергетического баланса организма, участвует в контроле работы сердечно-сосудистой системы и иммунной регуляции, а в субэпендимной области присутствуют прогениторные и стволовые клетки, которые при условиях стимуляции цитокинами и хемокинами, выделяемыми микроглиоцитами и макрофагами, могут способствовать активизации восстановительных процессов в нервной ткани и препятствовать нейродегенерации. Исследования структурной организации и функционального статуса микроглии обладают высокой степенью новизны, поскольку сейчас наблюдается бум научной активности в области изучения различных аспектов нейровоспаления и связи этого биологического явления с нейродегенерацией, нейрогенезом, развитием нейропатической боли и проявлениями признаков старения со стороны структур нервной системы. Научная новизна конкретного исследования определяется тем, что оно направлено на анализ малоизученных клеточных популяций – микроглии и макрофагов субфорникального органа, субэпендимной области, а также, макрофагов сосудистого сплетения (клеток Колмера). Несмотря на многочисленные исследования, посвященные микроглии и макрофагам мозга в целом, особенности этих клеточных популяций остаются на сегодня слабо охарактеризованными. Особый интерес представляет дальнейшее изучение общей структуры и клеточного состава субфорникального органа, который остается на сегодня одной из самых загадочных структур мозга. Основные научные результаты, связанные с изучением этой структуры, были получены в 70-80х гг 20 в. В те же годы была установлена важная роль субфорникального органа в осморегуляции (Felix, 1976) и работе сердечно-сосудистой системы (Mangiapane, Simpson, 1983). В настоящее время очевидно, что все эти данные, а также сведения о клеточном составе субфорникального органа, медиаторной принадлежности его нейронов и пр., нуждаются в проверке и уточнении с использованием более современных методов, таких как конфокальная лазерная микроскопия и микроскопия сверхвысокого разрешения. В этом направлении исследований нами были получены чрезвычайно интересные результаты, указывающие на существование собственных катехоламинергических нейронов СФО. Взаимодействие катехоламинергических нервных волокон с макрофагами сейчас изучается в периферических структурах (в рамках разработки вопроса о "нейрогенном воспалении"), но о центральных механизмах их взаимодействия сведения малочисленны и противоречивы. По результатам проекта будут разработаны теоретические основы стратегии управления функциональным статусом микроглии с целью препятствия развитию нейровоспаления и нейродегенерации. В рамках выполнения проекта планируется создание новых технологий и патентоспособных диагностических методик (в том числе и импортозамещающих часть реагентов западного производства), получение свидетельств о регистрации РИД и публикация статей в ведущих отечественных и международных журналах.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В отчетном году были выполнены все запланированные работы. Применяемые в работе иммуногистохимические методы, в том числе, с использованием новых реагентов собственной запатентованной рецептуры и импортзамещенных реагентов, помогли разработать ряд протоколов для морфологического анализа, готовых ко внедрению в практику. Применение современных методов микроскопии и количественного анализа, позволили прояснить ряд вопросов, касающихся функционального статуса микроглии и макрофагов циркумвентрикулярных органов. Полученные данные позволили не только представить результаты в виде публикаций в рецензируемом научном журнале Scopus/WOS, но также зарегистрировать базу данных изображений (РИД). 1. Были проведены сортировка и отбор архивного материала из гистологического архива Отдела общей и частной морфологии ФГНУ «ИЭМ», что позволило создать группы препаратов мозга животных SHR и Вистар, не дожидаясь поступления животных закупки текущего года. 2. В связи с необходимостью импортзамещения ряда реагентов, была проведена апробация методик и разработка новых протоколов иммуногистохимического анализа. 3. Описана структурная организация микроглии и макрофагов субэпендимной зоны областей боковых и III желудочков мозга у животных с гипертрофией миокарда левого желудочка. 4. Подготовлена и опубликована статья в издании Scopus/WoS и представлены научные доклады на двух Всероссийских конференциях с международным участием. 5. С полученными в текущем году животными произведена постановка экспериментов по индукции провоспалительных реакций и воздействию блокирующих активацию микроглии реагентов. 6. Была подана заявка на регистрацию РИД. В результате проведенного анализа получены приоритетные данные о структурных и иммунофенотипических особенностях эпиплексусных и супраэпендимных макрофагов в норме и в условиях развития хронической артериальной гипертензии. Кроме того, получены предварительные сведения о реакциях микроглии и макрофагов циркумвентрикулярных структур мозга на провоспалительные стимулы раннего и пролонгированного действия. 1. В ходе адаптации иммуногистохимических методик с использованием импортозамещенных реагентов было показано, что использованные работы реагенты (маркеры микроглии, астроглии и эпендимной глии, а также запатентованные или представленные к патентованию растворы для демаскирования и разбавитель антител) эффективны для проведения иммуногистохимического исследования головного мозга. Наибольший интерес для Российского исследователя могут представлять антитела к кальций-связывающему белку Iba-1 клона JM36-62, которые, как было установлено, не только обеспечивают иммуноселективное выявление микроглии и макрофагов головного мозга, но и позволяют избежать ложноположительных результатов вследствие развития неспецифического фонового окрашивания. 2. Применение современных методов морфометрического анализа, а также конфокальной сканирующей микроскопии дало возможность провести анализ субпендимных клеток врожденного иммунитета крыс. Было показано, что субпендимная микроглия области боковых и III желудочка мозга половозрелых крыс Вистар и SHR содержит виментин, что может говорить о предактивированном статусе этих клеток. Важно, что отростки субпендимной микроглии контактируют с эпендимой желудочков головного мозга и спинномозговой жидкостью, что свидетельствует о возможности этих клеток контролировать состав ликвора желудочков мозга. 3. Проведенное морфологическое исследование позволило охарактеризовать фенотипические особенности клеток Колмера и супраэпендимных макрофагов у нормотензивных (Вистар) и гипертензивных крыс (SHR). У крыс линии SHR обнаружены отчетливые признаки активации клеток эпиплексусных и супраэпендимных макрофагов, включающие сокращение и утолщение отростков, приводящее к изменению формы клеток с отростчатой на округлую, а также положительная иммуногистохимическая реакция на виментин. Получены количественные данные, дополнительно характеризующие реакцию хронической активации макрофагов сосудистого сплетения и вентрикулярных макрофагов у крыс на фоне артериальной гипертензиии. 4. Протоколы модуляции активности микроглиоцитов и макрофагов головного мозга, использованные в текущем году, продемонстрировали высокую эффективность и значимость для дальнейших фундаментальных и прикладных исследований. В частности, показано, что препарат Streptococcus pyogenes, полученный в ФГБНУ «ИЭМ», обладает достаточной эффективностью для активации микроглии и макрофагов в тканях, защищенных различными энцефалическими барьерами, и пригоден для индукции нейровоспаления, сопоставимого с развивающимся при введении липополисахарида E. coli. На основании анализа различных условий дозировок и длительности воздействия гадолиния хлорида (III) выявлены единые морфологические изменения изучаемых клеток при индукции и прогрессии нейровоспалительного процесса, характерные для всех изученных экспериментальных групп. На основании полученных данных выдвинута гипотеза о том, что вероятный механизм ингибирования микроглии и макрофагов треххлористым гадолинием заключается не в действии на рецепторы и переключении поляризации на альтернативную, а в истощении пула фагоцитирующих клеток. 5. По результатам первого года реализации Проекта опубликована статья, реферируемая в международных базах данных, представлены 2 доклада на конференции. Подготовлена и зарегистрирована база данных изображений микроглии субэпендмных областей головного мозга крыс, которая может быть использована в качестве референтных материалов для фундаментальных и доклинических исследований. https://vestnik.rsmu.press/archive/2024/3/8/abstract?lang=en https://pavlov-conf.ru/wp-content/uploads/2024/09/programma_konferencziya-pavlova.pdf https://genrussia.ru/poster

Публикации

1. Разенкова В.А., Кирик О.В., Павлова В.С., Коржевский Д.Э. Identification of microglia and macrophages using antibodies to various sequences of the Iba-1 protein Bulletin of Russian State Medical University, no. 3, p. 13–19 (год публикации - 2024)
10.24075/brsmu.2024.026

2. Коржевский Д.Э., Гусельникова В.В., Кирик О.В., Суфиева Д.А., Разенкова В.А. Новые подходы к изучению морфологии и функционального статуса микроглиоцитов in situ Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием "Учение академика И. П. Павлова в современной системе нейронаук", посвященная 175-летию со дня рождения академика И. П. Павлова и 120-летию со дня вручения академику И. П. Павлову Нобелевской премии: сборник тезисов докладов, с. 399 (год публикации - 2024)

3. Разенкова В.А., Коржевский Д.Э. Характеристика морфофункционального состояния сосудистого сплетения крыс линии SHR после внутрибрюшинного введения хлорида гадолиния (III) Сборник трудов Курчатовского геномного форума 2024, с. 74-75 (год публикации - 2024)

4. Павлова В.С., Гусельникова В.В., Коржевский Д.Э. Iba-1 иммунопозитивные клетки миокарда спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) Цитология, Т. 67, № 4, с. 247-254 (год публикации - 2025)
10.7868/S3034606125040041

5. Разенкова В.А., Кирик О.В., Коржевский Д.Э. Microglia of lateral ventricles in Spontaneously hypertensive rats: morphofunctional characteristics Cell and Tissue Biology, Vol. 19, no. 4, p. 327–335 (год публикации - 2025)
10.1134/S1990519X25600115

6. Разенкова В.А., Кирик О.В., Коржевский Д.Э. Microglia immunophenotyping in paraffin sections of the brain Cell and Tissue Biology, Vol. 19, no. 6, p. 597–604 (год публикации - 2025)
10.1134/S1990519X25600541

7. Гусельникова В.В., Кирик О.В., Суфиева Д.А., Разенкова В.А., Коржевский Д.Э. Микроглия и макрофаги структур головного мозга крысы Официальный бюллетень «Программы для ЭВМ. Базы данных. Топологии интегральных микросхем», № 9, свидетельство № 2025623515 (год публикации - 2025)

8. Никитина И.А., Кирик О.В., Коржевский Д.Э Способ выявления гломерул в почке человека Официальный бюллетень «Изобретения. Полезные модели» (год публикации - 2025)

9. Яковлев В.С., Суфиева Д.А. Использование антител к гликопротеину CD68 (макросиалину) для выявления макрофагов в эпифизе крысы Актуальные проблемы биомедицины – 2025: Материалы XXXI Всероссийской конференции молодых учёных с международным участием, Санкт-Петербург, 20-21 марта 2025 года / Отв. ред. Т.Д. Власов. СПб.: РИЦ ПСПбГМУ, с. 219-220 (год публикации - 2025)

10. Гусельникова В.В., Кирик О.В., Суфиева Д.А., Разенкова В.А., Коржевский Д.Э. Молекула Iba-1 – объект и инструмент в нейробиологических исследованиях (Сочи, 23–28 апреля 2025): НАУЧНЫЕ ТРУДЫ. М.: Издательство «Медицина–Здоровье», с. 24 (год публикации - 2025)

11. Яковлев В.С., Суфиева Д.А., Коржевский Д.Э. Сравнительная характеристика Iba-1+ -клеток и их распределение в эпифизе разновозрастных крыс Новости Медико-биологических наук, Т.25, №3, с. 169 (год публикации - 2025)

12. Разенкова В.А., Кирик О.В., Коржевский Д.Э. Микроглиальные клетки пролиферативных зон головного мозга – возможные участники нейрогенеза Современные проблемы нейробиологии. Материалы V международной научной конференции. Ярославль: ФГБОУ ВО ЯГМУ Минздрава России, с. 57-58 (год публикации - 2025)

13. Яковлев В.С., Суфиева Д.А., Коржевский Д.Э. Сравнительно-морфологическая характеристика клеток эпифиза головного мозга, содержащих CD68 и Iba-1 Сборник научных трудов Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии». М.: Научно-исследовательский институт морфологии человека имени академика А.П. Авцына (год публикации - 2025)

14. Кирик О.В., Файзов М.С., Коржевский Д.Э. Возрастные особенности распределения CD68-иммунопозитивных макрофагов в сосудистом сплетении головного мозга крыс Volga Neuroscience Meeting 2025. Тезисы Пятой международной конференции, c. 28-29 (год публикации - 2025)

15. Кирик О.В., Алексеева О.С., Разенкова В.А., Никитина И.А., Подсумкова Ю.М., Бекетова А.А., Коржевский Д.Э. Гломерулярные Iba-1-иммунопозитивные клетки почки человека Журнал эволюционной биохимии и физиологии (год публикации - 2025)

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В отчетном году были выполнены все запланированные работы. 1. На крысах Wistar и SHR произведена постановка экспериментов по индукции системного воспаления, а также проведено поисковое исследование различных способов блокировки нейровоспаления. Это позволило получить материал для выбора лучшего протокола для испытания методов управления активностью макрофагов и микроглии. 2. Исследована микроглия и макрофаги с характеристикой их популяционной принадлежности (M1/M2) при постановке двойных иммуноцитохимических реакций у нормотензивных крыс и крыс с генетически детерминированной артериальной гипертензией (SHR). 3. Отработаны методики работы с реагентами, полученными в текущем отчетном году, для их эффективного использования на экспериментальном материале. 4. Для отработки методики двойных иммунофлуоресцентных реакций было проведено тестирование высокоафинных вторичных реагентов (антитела козы, осла и альпаки). 5. На полученных препаратах с двойным иммуномаркированием проведена количественная оценка колокализации изучаемых маркеров. 6. Подготовлены и опубликованы 3 статьи в изданиях Scopus, приняты к печати еще две публикации и представлены научные доклады на шести Всероссийских научных конференциях. 7. Были подготовлены и поданы заявки на регистрацию двух РИД – базы данных и патента. В результате проведенного исследования получен большой массив данных, касающихся популяций микроглиоцитов и макрофагов сосудистого сплетения и субэпендимной зоны областей боковых и III желудочков мозга крыс как в норме, так и при модификации функционального статуса микроглии in vivo. 1. Из материалов проведенных экспериментов и ранее сформированного архива были использованы срезы головного мозга, печени и почки, необходимые для сравнительного анализа иммунореактивности антител к Iba-1, CD68, CD163, CD86, CD206, Аргиназе-1, ранее не использовавшихся исполнителями проекта. Показана высокая эффективность большинства маркеров. 2. С использованием методов иммуногистохимии, конфокальной микроскопии, а также с применением методов морфометрического и статистического анализа было получено несколько массивов изображений и числовых данных, часть из которых включена в зарегистрированную базу данных. 3. Полученный массив трехмерных изображений микроглиоцитов позволил провести пространственный Шолль-анализ для морфометрической оценки функционального статуса микроглии в норме (крысы Wistar) и при артериальной гипертензии (крысы SHR). Показано, что микроглия у SHR имеет особый характер ветвления, который говорит о переходе микроглии из покоящегося в активированное состояние, что дополнительно подтверждает ранее полученные данные о хронической активации микроглии в головном мозге у крыс на фоне развития артериальной гипертензии. 4. В ходе иммунофенотипирования субэпендимных и эпиплексусных макрофагов у крыс Wistar и SHR выявлена одновременная локализация антигенов Iba-1 и CD68 в субэпендимных клетках и микроглии гипоталамуса, а также в менингеальных и периваскулярных макрофагах. Как Iba-1, так и виментин присутствуют в суб- и супраэпендимных клетках боковых и третьего желудочков крыс SHR. Особенности клеточной морфологии Iba-1+/CD68+ и Iba-1+/виментин+ клеток позволяет сделать предположение, что возможном типом поляризации является не M1, а M2a. 5. С использованием высокафинных антител козы, осла и альпаки были отработаны оптимальные варианты протоколов, использование которых позволило обеспечить удовлетворительную сохранность структуры нервной ткани и высокое качество иммуногистохимической реакции при минимальном уровне фона. Данный материал готовится к публикации, параллельно ведется подготовка патентной заявки. 6. Проведенное сравнительное морфометрическое исследование позволило выбрать наиболее удобный протокол фармакологической коррекции функционального состояния макрофагов и микроглии головного мозга. Было установлено, что для фармакологической активации микроглии и макрофагов головного мозга предпочтительно использовать парентеральное введение культуры Streptococcus pyogenes. Наиболее перспективным способом ингибирования микроглии как у крыс Wistar, так и у SHR, представляется применение блокаторов пуриновых рецепторов (клопидогрел, прасугрел, тиклопидин), что в деталях мере будет проанализировано в течение следующего отчетного периода. 7. По результатам второго года реализации проекта было подготовлено 4 статьи, из которых опубликовано 3 и 1 принята к печати. Результаты проекта в текущем году были представлены в виде 4 устных и 2 стендовых докладов на всероссийских и международных научных конференциях. В ходе отработки методик для работ по Проекту были получены приоритетные данные, позволившие зарегистрировать базу данных изображений микроглии и макрофагов мозга крыс, а также подать заявку на патентование способа выявления гломерул почки человека с использованием реакции на микроглиальный белок Iba-1 (один из маркеров, трестировавшихся в рамках проекта на образцах разных тканей). https://link.springer.com/article/10.1134/S1990519X25600115 https://link.springer.com/article/10.1134/S1990519X25600541 https://www1.fips.ru/ofpstorage/BULLETIN/PrEVM/2025/09/20/INDEX.HTM http://physiology-cis.org/files/Tezis_2025.pdf https://elibrary.ru/download/elibrary_82971349_76421639.pdf

Публикации