Молекулярные механизмы и клинико-генетические характеристики новых форм спиноцеребеллярных атаксий

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-15-00209

НазваниеМолекулярные механизмы и клинико-генетические характеристики новых форм спиноцеребеллярных атаксий

Руководитель Иллариошкин Сергей Николаевич, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научный центр неврологии" , г Москва

Конкурс №92 - Конкурс 2024 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-106 - Нейробиология

Ключевые слова Наследственные спиноцеребеллярные атаксии, биомаркеры, экспансия микросателлитных повторов, экспериментальные модели, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, нейроны, митохондрии, нейродегенерация, иммуногистохимия, ультраструктура

Код ГРНТИ76.00.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Наследственные спиноцеребеллярные атаксии (НСЦА) – обширная группа нейродегенеративных заболеваний, проявляющихся прогрессирующим расстройством координации движений. Распространенность НСЦА составляет около 1 случая на 10 000 населения, что позволяет отнести их к числу наиболее частых патологий в нейрогенетике. НСЦА проявляются у лиц трудоспособного возраста и ведут к тяжелой инвалидизации пациентов, поэтому данные заболевания представляют собой социально значимую проблему во всем мире. На сегодня известно 50 генов аутосомно-доминантных и более 110 генов аутосомно-рецессивных НСЦА; этой группе болезней свойственно многообразие каузальных мутаций, наиболее значимыми из которых являются «динамические» мутации по типу экспансии микросателлитных повторов. Для большинства НСЦА отсутствуют эффективные патогенетические методы лечения, поэтому раскрытие ключевых молекулярных механизмов развития нейродегенеративного процесса при данных патологиях, в том числе на моделях in vitro и in vivo, представляет собой важную задачу современной неврологии. Последние несколько лет ознаменовались целой серией открытий новых форм НСЦА. Среди них наибольший интерес вызывают следующие 5 заболеваний: – SCA27B (SpinoCerebellar Ataxia type 27 B), аутосомно-доминантная форма, обусловленная экспансией GAA-повторов в некодирующей области гена FGF14; – болезнь с нейрональными внутриядерными включениями, или NIID (Neuronal Intranuclear Inclusion Disease), аутосомно-доминантная нейродегенеративная патология с широкой вариабельностью клинических проявлений, связанная с экспансией GGC-повторов в 5’-области гена NOTCH2NLC; – CANVAS (от англ. Cerebellar Ataxia, Neuropathy, Vestibular Areflexia Syndrome), аутосомно-рецессивная форма, обусловленная биаллельной экспансией AAGGG-повторов во 2-м интроне гена RFC1; – две аутосомно-доминантные полиглутаминовые формы НСЦА – ATX-THAP11 (экспансия CAG-повторов в гене THAP11) и SCA17 (экспансия CAG-повторов в гене транскрипционного фактора TBP). Судя по предварительным исследованиям в различных популяциях мира, на новые формы НСЦА (CANVAS, SCA27B, NIID) может приходиться весьма значительная доля всех форм дегенеративных атаксий среди лиц взрослого возраста (суммарно – до 35-40%), что делает чрезвычайно актуальным анализ молекулярных механизмов и клинико-генетических характеристик этих заболеваний. В российской популяции до настоящего времени указанные новые формы НСЦА не изучались. В представленном проекте впервые будет предпринято комплексное исследование новых форм НСЦА на трех уровнях: 1) в клинике (анализ популяционной частоты изучаемых форм, гено-фенотипические корреляции, разработка ранних биомаркеров и диагностических алгоритмов); 2) в эксперименте in vitro на нейрональных культурах, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) пациентов; 3) в эксперименте in vivo – на крысах с токсическими моделями дегенеративных атаксий, получаемых путем системного и интравентрикулярного введения специфических нейротоксинов (3-ацетилпиридина, агонистов TRPC3 и др.). Фенотипические особенности изучаемых новых форм НСЦА и биологическая роль белковых продуктов соответствующих генов позволяют постулировать ключевую роль митохондрий в реализации нейротоксических каскадов при данных заболеваниях. Это определяет парадигму изучения дегенеративных атаксий с новых позиций, а именно: исследование морфофункциональной организации митохондрий, анализ маркеров митохондриальной динамики и соответствующих терапевтических мишеней. Для решения поставленных задач в работе будет использован современный комплекс биохимических, молекулярно-генетических, физиологических, морфологических, иммуногистохимических и ультраструктурных исследований. Выявление общих звеньев патогенеза для геноспецифичных моделей НСЦА на клетках и для нейродегенеративных токсических моделей атаксий на животных может способствовать клинической валидации новых биомаркеров и разработке новых стратегий лечения НСЦА.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
1. Клинические исследования: поиск новых форм спиноцеребеллярных атаксий (СЦА) у российских пациентов. ДНК-анализ на СЦА17 позволил выявить эту форму атаксий у 7 (2,1%) неродственных больных. Аутосомно-доминантное наследование было в 3 семьях, остальные случаи спорадические. Выявлена статистически значимая обратная корреляция между числом CAG/САА-повторов в гене TBP и возрастом начала заболевания. Установленный фенотип СЦА17: мозжечковая атаксия с нистагмом и дизартрией (7 больных из /7), когнитивные и психиатрические нарушения (6/7), экстрапирамидные расстройства (5/7), апраксия (4/7), амиотрофии (4/7) и др. По данным МРТ у всех пациентов выявлена панцеребеллярная атрофия, у 5/7 пациентов – атрофия больших полушарий, у пациента с наибольшей экспансией 57 CAG/CAA повторов – легкая атрофия ствола мозга. Таким образом, фенотип при СЦА17 является гетерогенным и полисиндромным, что может быть связано с большей распространенностью дегенеративного процесса по сравнению с другими формами СЦА. ДНК-анализ на ATX-THAP11 проведен у 450 пациентов с атаксиями: пациенты с носительством экспансии в гене THAP11 выявлены не были. ДНК-анализ на болезнь с нейрональными внутриядерными включениями (NIID) с оценкой экспансии GGC-повторов в гене NOTCH2NLC также не выявил данной мутации у обследованных пациентов. Скрининг на синдром CANVAS путем анализа экспансии AAGGG-повторов в гене RFC1 проведен у 310 пациентов. Сформирована репрезентативная выборка пациентов с CANVAS: 40 пациентов (12,9%) – носители биаллельной экспансии AAGGG-повторов в гене RFC1. Были также выявлены 12 пациентов – гетерозиготные носители патогенной экспансии AAGGG-повторов. В неврологическом статусе у всех пациентов наблюдались мозжечковая и сенситивная атаксия, сенсорная полиневропатия, глазодвигательные нарушения. На МРТ выявлялась легкая и умеренная атрофия мозжечка, на ЭНМГ – признаки сенсорной и сенсомоторной аксональной полиневропатии. Признаки двусторонней вестибулопатии определялись у всех обследованных лиц. Таким образом, в нашей когорте наблюдался «полный» синдром CANVAS с сочетанием мозжечковой атаксии, сенсорной и сенсомоторной полиневропатии и двусторонней вестибулопатии, типичным возрастом дебюта и медленным темпом прогрессирования. Скрининг на СЦА27В проведен у 52 пациентов с прогрессирующими атаксиями. Сформирована группа пациентов с верифицированным диагнозом СЦА27В – 8 неродственных больных (15,4%) с носительством патогенной экспансии GAA-повторов в гене FGF14. Аутосомно-доминантное наследование наблюдалось в 4 семьях, в 1 семье выявлен феномен антиципации. У всех пациентов наблюдались мозжечковый нистагм, статико-локомоторная и динамическая мозжечковая атаксия. Другими симптомами были мозжечковая дизартрия, сенситивный компонент атаксии, пирамидные знаки. У 5/8 пациентов при проведении стимуляционной ЭНМГ выявлялись признаки симметричной сенсорной аксональной полиневропатии. На МРТ у 5/8 пациентов выявлялась умеренно выраженная атрофия червя и полушарий мозжечка. У обследованных пациентов были выявлены различные признаки вестибулопатии. Впервые в славянской семье была выявлена чрезвычайно редкая форма аутосомно-доминантной атаксии – дентаторубро-паллидолюисова атрофия (ДРПЛА), подтвержденная путем установления экспансии CAG-повторов в гене ATN1 (n=66 повторов в одном из аллелей гена). 2. Экспериментальные исследования in vitro: клеточные основы СЦА17. При анализе особенностей экспрессионного профиля, дифференцировочного и пролиферативного потенциала, митохондриальной активности и динамики в ИПСК и нейрональных предшественниках, полученных от пациента СЦА17, впервые зарегистрирован ряд принципиальных отличий в их функционировании и развитии по сравнению с контрольными клетками здоровых доноров. Зарегистрированные изменения включают нарушение активности митохондрий, нарушение митохондриальной динамики, интенсификацию митохондриального биогенеза и Pax6-опосредованных процессов нейрональной дифференцировки. Эти отличия подчеркивают важность митохондриальной дисфункции и нарушений в динамике митохондрий в патогенезе СЦА17 и могут служить основой для разработки новых терапевтических стратегий. При электронной микроскопии основным патологическим признаком органоидов СЦА17 было наличие большого количества вакуолей в клетках; другое изменение митохондрий в СЦА17 – нарушение структуры крист. Исследованные органоиды по своим ультраструктурным характеристикам являлись незрелыми. Выявленные нами изменения ультраструктуры органоидов СЦА17 включали различные пути изменения митохондрий, их фрагментацию, появление гигантских митохондрий, появление большого количества вакуолей, нарушение белок-синтезирующего аппарата. 3. Экспериментальные исследования in vivo. При моделировании атаксии с помощью внутрибрюшинного введения специфического нейротоксина 3-ацетилпиридина (3-АП) у самцов крыс Вистар через 12-15 ч развивались критические нарушения движения и координации. Через 4 нед. величина пройденной дистанции оказалась значительно меньше зафиксированной до введения 3-АП, также было выявлено увеличение времени неподвижности через 4 нед. и 6 нед. после начала эксперимента. При морфологическом исследовании головного мозга у всех животных выявили повреждение коры мозжечка и нейронов оливарного комплекса, выраженную дегенерацию нейронов Пуркинье, разряжение гранулярного слоя коры мозжечка, снижение реакции на цитохромоксидазу С в клетках Пуркинье и в гранулярном слое, снижение окрашивания отростков астроцитов на кислый глиофибриллярный белок. Таким образом, введение 3-AP вызывает выраженные структурные изменения в коре мозжечка экспериментальных животных, вызывает дегенеративные изменения клеток Пуркинье и нарушает распределение цитохромоксидазы С в клетках гранулярного слоя. По итогам работы опубликованы 3 статьи, еще одна статья принята в печать.

Публикации

1. Давиденко А.В., Лагарькова М.А., Иллариошкин С.Н., Богомазова А.Н. Клинические и молекулярно-генетические аспекты спиноцеребеллярной атаксии 17 типа Нервные болезни (год публикации - 2025)

2. Нужный Е.П., Абрамычева Н.Ю., Проценко А.Р., Белякова-Бодина А.И., Ларина Е., Федотова Е.Ю., Клюшников С.А., Иллариошкин С.Н. Clinical and video-oculographic characteristics of spinocerebellar ataxia type 27B (GAA-FGF14 ataxia): a single-center retrospective study Clinical and Translational Neuroscience, Vol. 8 (29) (год публикации - 2024)
10.3390/ctn8040029

3. Нужный Е.П., Белякова-Бодина А.И., Абрамычева Н.Ю., Филатов А.С., Иллариошкин С.Н. Фенотипическое разнообразие и трудности диагностики синдрома CANVAS Российский неврологический журнал, Том 29, №5, С.32–37 (год публикации - 2024)
10.30629/2658-7947-2024-29-5-32-37

4. Коцоев Г.А., Нужный Е.П., Зарипова Л.Р., Уразгильдеева Г.Р., Брсикян Л.А., Клюшников С.А., Федотова Е.Ю., Проценко А.Р., Абрамычева Н.Ю., Матсон М.Д., Иллариошкин С.Н. Дентаторубропаллидольюисова атрофия: редкая форма аутосомно-доминантной атаксии у пациента славянского этнического происхождения Нервные болезни, №3, С.32-38 (год публикации - 2024)
10.24412/2226-0757- 2024-13156

5. Е. П. Нужный, Д. О. Земляная, С. Н. Иллариошкин Разнообразие клинических проявлений заболеваний, ассоциированных с геном RFC1 Нервно-мышечные болезни, том 15, N3, стр. 55-62 (год публикации - 2025)
10.17650/2222‑8721‑2025‑15‑3‑00‑00

6. Нужный Е.П., Невзорова К.В., Проценко А.Р., Абрамычева Н.Ю., Лясковик А.А., Белякова-Бодина А.И., Иллариошкин С.Н. Спиноцеребеллярная атаксия типа 27В (ATX-FGF14-GAA) Российский неврологический журнал, N4, стр. 32-37 (год публикации - 2025)
10.30629/2658-7947-2025-30-4-32-37

7. Д.Н.Воронков, А.В.Ставровская, К.А.Кутукова, И.А.Потапов, А.С.Романенко, А.К.Павлова, М.В.Иванов, С.Н.Иллариошкин Изменения клеток Пуркинье мозжечка под действием 3-ацетилпиридина Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Том 180, № 11, стр. 654-660 (год публикации - 2025)
10.47056/0365-9615-2025-180-11-654-660

8. М. Ю. Шарикова, А. В. Спасельникова, Т. В. Лиманская, В. В. Ненашева, Е. А. Степаненко, Т. П. Герасимова, Е. В. Новосадова, Е. А. Воловиков, М. Е. Богомякова, Е. А. Зеркаленкова, Е. П. Нужный, А. Н. Богомазова, О. С. Лебедева, М. А. Лагарькова, С. Н. Иллариошкин Создание линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток RCPCMi017-A с помощью репрограммирования дермальных фибробластов пациента с синдромом CANVAS Russian Journal of Developmental Biology, №6 (т.56) (год публикации - 2026)

9. А. В. Спасельникова, Е. А. Балезина, М. Ю. Шарикова, Е. А. Воловиков, Т. В. Лиманская, В. В. Ненашева, Е. А. Степаненко, Т. П. Герасимова, Е. В. Новосадова, М. Е. Богомякова, Е. А. Зеркаленкова, Е. П. Нужный, А. Н. Богомазова, О. С. Лебедева, М. А. Лагарькова, С. Н. Иллариошкин Создание линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток RCPCMi016-A и RCPCMi016-B с помощью репрограммирования дермальных фибробластов пациента со спиноцеребеллярной атаксией 27В типа Russian Journal of Developmental Biology, №6 (т.56) (год публикации - 2025)

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
1. Клинические исследования: поиск новых форм спиноцеребеллярных атаксий (СЦА) у российских пациентов. В отчетном году в российских семьях со спиноцеребеллярными атаксиями выявлены и генетически верифицированы 20 новых случаев синдрома CANVAS. Таким образом, суммарно российская выборка случаев CANVAS, выявленных за 2 года работы, составила 60 пациентов, возраст 63,6±10,3 лет, возраст начала 52,8±10,7 лет. Клиническая картина у большинства пациентов: аксональная (преимущественно сенсорная) полиневропатия, дискоординация, двусторонняя вестибулопатия, автономные нарушения. Носители патологической AAGGG-экспансии в гене RFC1 у пациентов с боковым амиотрофическим склерозом (БАС) обнаружены не были, что показывает редкость RFC1-ассоциированной формы БАС в российской популяции. Отоневрологическое обследование показало у большинства пациентов с CANVAS признаки двусторонней вестибулопатии. Полученные результаты подтверждают необходимость проведения видеопробы Хальмаги как ключевого видеоокулографического теста, позволяющего заподозрить у пациентов с прогрессирующей атаксией наличие CANVAS. В отчетном году верифицированы 6 новых пациентов – носителей экспансии 273–414 GAA-повторов в гене FGF14 (18,7% от всех обследованных семей). Таким образом, суммарно российская выборка случаев СЦА27В, выявленных за 2 года работы, составляет 14 больных (по 50% мужчин и женщин): возраст – 63,6±12,3 лет, возраст начала – 56,1±12,8 лет. У всех пациентов наблюдались мозжечковая атаксия, нистагм, частно имелись дизартрия (78%), когнитивные нарушения (50%), пресбивестибулопатия (45%), сенсомоторная полиневропатия (43%). На МРТ в 64% случаев выявлялась атрофия мозжечка, а специфический признак СЦА27В – гиперинтенсивность верхних мозжечковых ножек – выявлен у 4 (28,5%) больных. У трех пациентов число GAA-повторов в гене FGF14 составило 181, 196 и 199 копий – это аллели с «промежуточной» экспансией и неполной пенетрантностью. Течение заболевания у данных пациентов характеризовалось гемидистонией или выраженными когнитивными нарушениями, что может свидетельствовать о возможности развития атипичных фенотипов СЦА27В у пациентов с «промежуточными» экспансиями. 2. Экспериментальные исследования in vitro: клеточные основы синдрома CANVAS. Детально охарактеризованы индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) и нейрональные предшественники (НП) от пациента с CANVAS и здоровых лиц. Выявлен зависимый от степени дифференцировки феномен митохондриальной недостаточности при CANVAS: в ИПСК – сдвиг равновесия в сторону повышенного деления митохондрий и компенсаторного слияния, в НП – выраженная деполяризация митохондриальной мембраны, значительное увеличение продукции активных форм кислорода, активация митофагии. Функциональные последствия митохондриальной дисфункции проявились снижением пролиферативной и миграционной активности НП при CANVAS. С учетом ключевой роли НП в формировании нейронов мозжечка и поддержании нейронального гомеостаза такие изменения могут лежать в основе прогрессирующей мозжечковой дегенерации, характерной для CANVAS. Таким образом, впервые продемонстрировано, что митохондриальные нарушения при CANVAS отсутствуют на этапе плюрипотентности, но проявляются на стадии НП (стадийно-зависимая уязвимость нейрогенеза) и, вероятно, предшествуют патологии клеток Пуркинье и синаптической дисфункции в мозжечке. 3. Экспериментальные исследования in vivo. В отчетном году создана комбинированная модель спиноцеребеллярной атаксии (СЦА): она индуцирована внутрибрюшинным введением 3-AP и интрацеребровентрикулярным введением липополисахарида (ЛПС) с целью активации микроглии. Разработана система балльной оценки двигательного статуса животных с учетом особенностей моторного фенотипа СЦА. При иммуноморфологическом исследовании мозга крыс с моделью СЦА на фоне внутрибрюшинного введения 3-АР установлено изменение ганглионарного слоя коры мозжечка, выявлены сморщенные тела клеток Пуркинье, снижение окраски сомы клеток на цитохромоксидазу. Выявлено снижение окрашивания на AldC в телах и аксонах клеток ганглионарного слоя и значимое снижение плотности AldC-экспрессирующих нейронов в черве мозжечка, в гранулярном слое – снижение уровня окрашивания на синаптофизин и увеличение уровня GFAP, что указывает на патологию синапсов и реактивные изменения астро- и микроглии. При электронной микроскопии у животных с моделью 3-AP-атаксии наблюдалась патология клеток Пуркинье с повышением электронной плотности цитоплазмы и цитозоля, сближением органелл, конденсацией хроматина. Митохондрии были преимущественно мелкие, вытянутые, с различимыми, регулярно расположенными кристами и электронно-плотным матриксом. Отростки астроцитов, окружающие «тёмные» клетки Пуркинье, были электронно-прозрачными, набухшими, нейропиль – ультраструктурно сохранным, дегенерирующих отростков выявлено не было. Клетки зернистого слоя и клубочки мозжечка были ультраструктурно сохранными, однако снижение экспрессии синаптофизина свидетельствовало о функциональных изменениях клубочков мозжечка. Все вышеуказанное говорит о постепенном развитии структурных нарушений при введении 3-AP. В 2025 году получены предварительные результаты поведенческого тестирования крыс с комбинированной моделью СЦА. Показано, что двигательные нарушения развивались лишь у 20 % животных и значительно ослабевали уже через 5 дней. При этом животные с первого дня после введения 3-АП сохраняли способность самостоятельно принимать пищу и не нуждались в дополнительном уходе. Результаты физиологических исследований по данной теме находятся в процессе обработки, морфохимическое исследование образцов целевых структур мозга в настоящее время продолжается (результаты будут представлены в следующем году). По итогам работы опубликованы или приняты в печать 5 статей.

Публикации