Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В ходе выполнения работ проекта в 2024 году, согласно плану, были проведены эксперименты по выявлению мишеней, ингибирование которых может привести к накоплению свободных порфиринов внутри микобактериальных клеток. Для этого были отобраны конкретные ферменты в путях метаболизма тетрапироллов в микобактериях, ингибирование которых, предположительно может привести к накоплению флуоресцирующих интермедиатов в микобактериях. Были получены мутантные штаммы M. smegmatis с делециями генов метилтрансфераз, участвующих в метаболизме тетрапироллов - метилтрансфераза копропорфирина MSMEG_0614 и уропорфириноген-III С-метилтрансфераза MSMEG_0954. Было установлено, что в этих мутантных штаммах происходит увеличение количества эндогенных порфиринов, преимущественно копропорфирина и уропорфирина, по сравнению с диким типом. Как при делеции гена MSMEG_0614, так и при делеции гена MSMEG_0954, в клетках M. smegmatis развивается фоточувствительность к длине волны света 565 нм, особенно при выращивании в присутствии 5-аминолевулиновой кислоты. У клеток штамма с делецией гена MSMEG_0614 развивается также чувствительность к действию света с длиной волны 640 нм. Таким образом, оба выбранных фермента могут являться потенциальными мишенями для разработки новых ингибиторов с целью улучшения эффективности антибактериальной фотодинамической терапии в отношении микобактерий. При проведении протеомного анализа мембранных белков микобактерий, находящихся в условиях, при которых происходит активный синтез и секреция порфиринов было выявлено 3169 белков. Среди них концентрация 121 белка достоверно увеличивается в 2 и более раз в момент выброса порфиринов из микобактериальной клетки. Были выделены 17 основных белков, которые мы далее планируем изучать как предположительные экспортёры порфиринов. Были синтезированы новые конъюгаты трегалозы с трикарбоцианином (ТСС), которые активируются светом с длиной волны 740 нм. Синтезированный ТСС2Тре, согласно данным ВЭЖХ и масс-спектрометрии, представлял собой смесь шести изомеров из-за способности трегалозы образовывать сложные эфиры по различным атомам углерода. Преобладающим изомером был диэфир, связанный с шестым атомом углерода в обеих единицах трегалозы. Абсорбция ТСС2Тре, связанного с микобактериями, на порядок выше, чем у ТСС. Как и ожидалось, включение трегалозы в молекулярную структуру ТСС значительно усиливает его связывание с микобактериальными клетками. Получены данные in vitro по эффективности фотодинамической инактивации вегетативных и покоящихся форм M. smegmatis и M. tuberculosis при использовании трикарбоцианиновых красителей в зависимости от состава и концентрации ФС, времени инкубации бактерий с ФС и дозы света. ТСС2Тре продемонстрировал лучшее связывание с клетками M. smegmatis по сравнению с неконъюгированным ТСС. Соответственно, фотоинактивация M. smegmatis с ТСС2Тре была более выраженной, чем с ТСС. Специфичность ТСС2Тре к микобактериям была очевидна из сравнения его фотоактивности против бактерий с различной структурой клеточной стенки. Значительно меньшая чувствительность покоящихся клеток M. smegmatis к фотосенсибилизаторам и меньшее различие в чувствительности между ТСС2Тре и ТСС могут быть обусловлены достаточно подавленным метаболизмом в покоящихся клетках и подавлением транспортных процессов. Фотоинактивация M. tuberculosis в присутствии ТСС2Тре более выражена по сравнению с фотоинактивацией M. smegmatis в тех же условиях. Получены данные по активности миелопероксидазы после светового воздействия на макрофаги, содержащие микобактерии, выращенные в присутствии 5-аминолевулиновой кислоты. Была получена линия макрофагов, содержащих флуоресцентный сенсор на гипохлорит. Также были получены штаммы E. coli и M. smegmatis, содержащие плазмиду со встроенным геном флуоресцентного белка Hypocrat, способного изменять максимум флуоресценции в присутствии гипохлорита. Были проведены эксперименты на изучение изменения флуоресценции белка Hypocrat, находящегося в бактериях при разной концентрации гипохлорита. Установлено, что в процессе аФДТ происходит статистически достоверное образование гипохлорита за счет фотодинамической активности порфиринов макрофагов. Для определения ключевых временных точек для изучение биохимических процессов, происходящих в микобактериях в составе биопленок после проведения фотоинактивации проводили оценку динамики дыхания, активности синтезов РНК, накопления поврежденных бактерий в биопленках через 0, 2, 4, 8, 16, 24 ч после светового воздействия. В отличие от планктонной культуры, которая погибает сразу после светового воздействия, в случае биопленок гибель микобактерий медленно развивается после прекращения действия света, что вряд ли может быть связано с непосредственным действием активных форм кислорода, а указывает на протекание некоторых вторичных процессов, приводящих к клеточной гибели. КОЕ M. tuberculosis в биопленках не изменяется в течение 8 ч после прекращения действия света. Затем наблюдалось резкое снижение количества КОЕ через 16 ч и далее наблюдалось более плавное снижение количества жизнеспособных микобактерий к 48 ч инкубации после светового воздействия. Подавление дыхательных процессов в биопленках начинается с 8-ми часов после светового воздействия и предшествует началу гибели бактерий. Активность включения Н3-урацила и, соответственно, активность синтезов РНК, снижается в 3.4 раза сразу после облучения, а через 24 часа после облучения активность синтеза РНК падает в 5.2 раза относительно необлученных биопленок. Таким образом, в отличие от планктонной культуры, гибель микобактерий в биопленках медленно развивается после прекращения действия света, что вряд ли может быть связано с непосредственным действием активных форм кислорода, а указывает на протекание некоторых вторичных процессов, приводящих к клеточной гибели. При этом, снижение активности дыхания, оцененного по активности ДФИ-редуктазы и с помощью резазуринового метода, происходит также медленно и коррелирует со снижением количества жизнеспособных бактерий. Однако активность синтезов РНК, оцененная по интенсивности включения Н3-урацила, значительно снижается сразу после облучения. Все запланированные работы в этот отчетный период выполнены в полном объеме.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В ходе выполнения работ проекта в 2025 году, согласно плану, были проведены эксперименты, нацеленные на идентификацию генетических мишеней, модулирующих развитие фоточувствительности у M. smegmatis, а также на всестороннюю оценку эффективности и механизмов действия фотодинамической инактивации (ФДИ) с использованием конъюгированных с трегалозой фотосенсибилизаторов (ФС) на основе гептаметинцианина (ПК225). Были получены и охарактеризованы немаркированные делеционные мутанты M. smegmatis: Δ2618 (сирогемсинтаза) и Δ3872 (прекоррин-8X метилмутаза). Анализ ВЭЖХ-HRMS показал, что делеции в этих генах, входящих в путь синтеза витамина В12, приводят к существенному накоплению метилированных производных копропорфирина. Гиперэкспрессия сирогемсинтазы (MSMEG_2618) также вызвала фенотипические изменения (серая окраска колоний, розовая УФ-флуоресценция) и накопление флуоресцентных интермедиатов (прекоррин-2, сирогидрохлорин), формируя внутриклеточные гранулярные структуры. Установлено, что накопление эндогенных тетрапирролов в мутантных штаммах критически повышает их чувствительность к свету (565 нм и 640 нм). Штамм Δ2618, выращенный в присутствии 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК) показал высокую чувствительность при 565 нм (смертность в 442 раза), и умеренную чувствительность при 640 нм (смертность в 3 раза). Штамм Δ3872 продемонстрировал выраженную фоточувствительность без добавления АЛК и экстремальную фоточувствительность при добавлении АЛК (снижение КОЕ в 32 000 раз), что значительно превышает эффект у штамма дикого типа. Гиперэкспрессия MSMEG_2618 также индуцировала повышенную фоточувствительность. Исследование распределения ФС ПК225 на мышах (Balb/C, ICR) показало, что интратрахеальное введение является наиболее эффективным для достижения пролонгированной локальной концентрации в легких (до 7–10 суток), с последующим медленным выведением через почки. Пероральный путь неэффективен из-за быстрого выведения через ЖКТ (30 часов) без системного всасывания. Внутривенное введение обеспечивало системное распределение с длительной аккумуляцией в легких и почках. Токсичность при всех способах введения не зафиксирована. Установлено, что ФДИ трикарбоцианиновыми красителями, конъюгированными с трегалозой (ПК225) показала высокую эффективность инактивации против M. tuberculosis, M. kansasii и M. fortuitum, но умеренную активность против M. avium и низкую против M. abscessus. Транскриптомный анализ биопленок M. tuberculosis, содержащих эндогенные порфирины, после ФДИ (565 нм, 200 Дж/см²) выявил быстрый ответ на оксидативный стресс: немедленную активацию генов антиоксидантной защиты (katG, sodC), стрессовых регуляторов (DosR, WhiB7) и репарации ДНК. Наблюдались метаболические сдвиги, включая потенциальное накопление метилглиоксаля. Отсроченный анализ (протеом и транскриптом до 48–96 часов) показал медленную адаптацию и частичное восстановление, несмотря на начальный массовый эффект ФДИ. Добавление АЛК стимулировало экспрессию генов предполагаемых экспортеров порфиринов (Rv2563-Rv2564) у M. tuberculosis. Таким образом, делеции сирогемсинтазы и прекоррин-8X метилмутазы, а также гиперэкспрессия сирогемсинтазы, яввляющиеся ферментами метаболизма тетрапирролов критически усиливают фотодинамическую активность, делая эти метаболические узлы перспективными мишенями для разработки новых антимикобактериальных подходов. Интратрахеальная доставка ФС ПК225 представляет собой многообещающую стратегию для лечения легочных инфекций благодаря длительной локальной экспозиции и отсутствию острых токсических проявлений. Все запланированные работы в этот отчетный период выполнены в полном объеме.