КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 24-15-00236
НазваниеРазработка подходов к таргетному повышению стабильности мРНК и эффективности ее трансляции с применением модифицированных олигонуклеотидов
Руководитель Аралов Андрей Владимирович, Кандидат химических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук , г Москва
Конкурс №92 - Конкурс 2024 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина
Ключевые слова трансляция, транскрипция, G-квадруплекс, мРНК, шпилька, модифицированные олигонуклеотиды, антисмысловые олигонуклеотиды
Код ГРНТИ31.25.15
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Актуальным направлением современной медицины является разработка подходов к лечению и профилактике заболеваний, сопровождающихся пониженным уровнем функциональных белков, например, аполипротеина С3 (ишемическая болезнь сердца) и фратаксина (атаксия Фридрейха). Повышение может достигаться за счет применения белковых препаратов, а также манипуляцией с кодирующей белок мРНК. В последнем случае часто наблюдается неэффективная или недостаточная продукция целевого белка, что может быть скорректировано увеличением эффективности трансляции и стабильности мРНК. Показано, что трансляцию можно целенаправленно усилить с помощью антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые компенсируют функцию негативных регуляторных элементов (шпилек), присутствующих в 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) некоторых мРНК. В свою очередь, повышение стабильности мРНК можно достигнуть при использовании АСО, а также введением устойчивых к действию экзонуклеаз химических модификаций в поли(A) хвост мРНК.
Настоящий проект можно разделить на два направления:
1) Специфическое воздействие на высокоструктурированные элементы в 5'-НТО мРНК с целью повышения эффективности трансляции
АСО можно применять не только для специфического понижения экспрессии генов за счет деградации транскриптов, но также для специфического повышения уровня белка за счет повышения эффективности трансляции мРНК. В этом случае мишенями АСО являются шпильки или кОРС (короткие открытые рамки считывания) в 5’НТО мРНК. Однако до настоящего времени в качестве мишеней АСО не рассматривали G-квадруплексы, которые также присутствуют в 5'-НТО и могут регулировать трансляцию. Таким образом, целесообразна разработка новых модификаций и принципов дизайна АСО с улучшенными свойствами, а также поиск высокоструктурированных элементов в 5'-НТО, способных регулировать эффективность трансляции.
Будет проведен поиск мишеней и опробован подход к повышению эффективности трансляции за счет таргетного воздействия. Подход основан на дизайне конструктов, содержащих низкомолекулярный фрагмент, способный разрушать классические GC пары в шпильках и G тетрады в G-квадруплексах, и олигонуклеотидную часть, обеспечивающую селективность за счет комплементарности к одноцепочечным фрагментам, фланкирующим вторичную структуру.
2) Разработка эффективных и масштабируемых способов получения функциональных конъюгатов мРНК с повышенной стабильностью
Химическая модификация синтетической мРНК, например, N1-метилпсевдоуридином, является перспективным способом повышения эффективности векторов мРНК. Альтернативные стратегии обеспечивают повышение стабильности мРНК за счет ферментативной достройки поли(А)-хвоста модифицированными нуклеотидами или ферментативного лигирования по 3'-концу модифицированных олигонуклеотидов (ОН). Однако, достройка имеет переменную эффективностью и дает поли(А)-хвосты переменной длины, а конъюгирование не позволяет получать конъюгаты мРНК в достаточных для терапевтических целей количествах.
Впервые будут опробованы подходы к повышению стабильности мРНК за счет масштабируемого химического конъюгирования ОН. Для этого будут разработаны соответствующие фосфорамидиты, вводимые по 5'-концу ОН и обеспечивающие эффективное конъюгирование. Для повышения стабильности конъюгатов мРНК будет опробован подход с применением модифицированных ОН, «удлиняющих» поли(А) хвост, и оригинальный принцип с «закольцовыванием» мРНК. В случае получения положительных результатов, будут проведены исследования эффективности разработанного подхода in vivo.
В ходе реализации проекта будет предложено и апробировано несколько подходов к таргетному повышению количеств белка за счет повышения эффективности трансляции и стабильности мРНК, применяя синтетические ОН. Полученные результаты могут найти применение в биологии (изучение функций белков) и медицине (специфическая коррекция дефицита белков при патологиях, повышение эффективности терапевтических средств на основе мРНК).
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Разработка подходов к таргетному повышению экспрессии белков актуальна для лечения заболеваний, связанных с их дефицитом, например, аполипротеина С3 (ишемическая болезнь сердца) и фратаксина (атаксия Фридрейха). Эта задача глобально может решаться двумя путями: за счет воздействия на эндогенные мРНК или введения экзогенных мРНК. Наш проект разделен на две части и направлен на 1) разработку модифицированных олигонуклеотидов (ОН) для повышения эффективности трансляции путем дестабилизации ингибирующих ее вторичных структур (шпилек и РНК G-квадруплексов (rG4)) в 5'-НТО мРНК; 2) увеличение стабильности экзогенных мРНК препаратов.
В рамках первого направления планируется модифицировать ОН по азотистому основанию и сахарному остатку для предотвращения деградации образующихся дуплексных фрагментов РНКазой Н и повышения эффективности дестабилизации структур. Поэтому в ходе первого года реализации проекта шел поиск низкомолекулярных соединений, будущих G4-дестабилизирующих модификаций для ОН, и структур-мишеней в терапевтически релевантных мРНК. Было синтезировано пять производных феноксазина и бензофеноксазина, которые способны искажать структуру G4 согласно данным КД-титрования. Наиболее эффективное среди них также было способно снижать температуру плавления G4 за счет стэкинга с наружной G-тетрадой и образования четырех водородных связей со свободными гуанинами, образующимися при локальном и временном разрушении G тетрад, как следует из данных микроскопического термофореза и ЯМР спектроскопии. При этом соединение малотоксично и способно повышать эффективность транскрипции гена cKit на 40%, что подтверждает способность 755 влиять на G4-регулируемые процессы в клетках. Для модификации ОН синтезировано два фосфороамидита на основе структуры 755, G-clamp и G-clamp с терминальным алкином, подобраны условия синтеза и очистки ОН. Для улучшения эффективности дестабилизации G4 синтезировано два азида для пост-синтетической модификации ОН с помощью “клик”-реакции.
Были апробированы две тест-системы для оценки эффективности трансляции: 1) на основе трансфекции in vitro транскрибированной, кэпированной и полиаденилированной мРНК, кодирующей люциферазу и содержащей исследуемый 5'-НТО; 2) на основе двойного люциферазного теста с трансфекцией плазмид и контролем уровня мРНК кПЦР. С помощью первой системы было установлено, что rG4 в 5'-НТО двух терапевтически релевантных мРНК CDK12 и Bcl2 ингибируют трансляцию на 30% и 40% по сравнению с не образующими rG4 мутантами соответственно.
В рамках исследования вторичной структуры регуляторных элементов в 5'-НТО мРНК DDX23 была определена структура соответствующих РНК фрагментов методами тиофлавинового теста и УФ-, КД- и ЯМР-спектроскопии. Только один из них был способен образовывать rG4, однако в небольшой доле в равновесии с превалирующей шпилькой, т.е. регуляторным элементом может выступать образуемая данным РНК фрагментом шпилька, а не rG4. Также была исследована структура стабильной шпильки после малой открытой рамки считывания (мОРС), которая с высокой вероятностью может регулировать соотношение эффективности трансляции малой и основной открытой рамки считывания (ОРС). G4-стабилизатор пиридостатин не оказывал влияния на эффективность трансляции мРНК DDX23, следовательно, в ее 5'-НТО нет регуляторных rG4, вопреки ранее опубликованным данным. Для выявленных и охарактеризованных шпилек, способных выступать регуляторами трансляции, был проведен дизайн и синтезированы LNA-модифицированные ОН, направленных на их разрушение.
Второй этап исследовательского проекта был сфокусирован на разработке масштабируемой методологии прямой химической модификации 3'-концевого участка мРНК. Предложенный подход основан на двухстадийном процессе: периодатном окислении 3'-концевого рибозного кольца с образованием диальдегидной группы и последующем восстановительном аминировании при взаимодействии с ОН, содержащими 5'-этилендиаминовую (EDA) группу. Предполагается, что такая модификация мРНК способна значительно повысить её стабильность и увеличить время жизни в клетке, что может обеспечить повышение эффективности продукции целевого белка на одну молекулу мРНК. Практическая значимость данного подхода заключается в возможности снижения терапевтических доз мРНК-препаратов, кодирующих различные биологически активные молекулы, включая факторы роста, антитела и гормоны. Успешно реализованы синтетические схемы получения двух 5'-EDA-модифицированных фосфорамидитов для их последующего включения в ОН. Оптимизированы условия синтеза и очистки 5'-EDA-модифицированных ОН. Проведена первичная экспериментальная оценка эффективности конъюгации мРНК с 3'-флуоресцентно меченным 5'-EDA-модифицированным ОН, содержащим остатки 2'-OMe рибонуклеотидов.
Полученные результаты создают основу для дальнейшей разработки терапевтических подходов, направленных на повышение экспрессии белков при различных заболеваниях.
Публикации
1. Камзеева П.Н., Шепелев Н.М., Северов В.В., Варижук А.М., Рубцова М.П., Аралов А.В. Регуляторные элементы в 5’-НТО мРНК гена DDX23 Научная конференция молодых ученых ФГБУ ФНКЦ ФХМ им. Ю.М. Лопухина ФМБА России (сборник тезисов), Москва (год публикации - 2024)