Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Разработка подходов к таргетному повышению экспрессии белков актуальна для лечения заболеваний, связанных с их дефицитом, например, аполипротеина С3 (ишемическая болезнь сердца) и фратаксина (атаксия Фридрейха). Эта задача глобально может решаться двумя путями: за счет воздействия на эндогенные мРНК или введения экзогенных мРНК. Наш проект разделен на две части и направлен на 1) разработку модифицированных олигонуклеотидов (ОН) для повышения эффективности трансляции путем дестабилизации ингибирующих ее вторичных структур (шпилек и РНК G-квадруплексов (rG4)) в 5'-НТО мРНК; 2) увеличение стабильности экзогенных мРНК препаратов. В рамках первого направления планируется модифицировать ОН по азотистому основанию и сахарному остатку для предотвращения деградации образующихся дуплексных фрагментов РНКазой Н и повышения эффективности дестабилизации структур. Поэтому в ходе первого года реализации проекта шел поиск низкомолекулярных соединений, будущих G4-дестабилизирующих модификаций для ОН, и структур-мишеней в терапевтически релевантных мРНК. Было синтезировано пять производных феноксазина и бензофеноксазина, которые способны искажать структуру G4 согласно данным КД-титрования. Наиболее эффективное среди них также было способно снижать температуру плавления G4 за счет стэкинга с наружной G-тетрадой и образования четырех водородных связей со свободными гуанинами, образующимися при локальном и временном разрушении G тетрад, как следует из данных микроскопического термофореза и ЯМР спектроскопии. При этом соединение малотоксично и способно повышать эффективность транскрипции гена cKit на 40%, что подтверждает способность 755 влиять на G4-регулируемые процессы в клетках. Для модификации ОН синтезировано два фосфороамидита на основе структуры 755, G-clamp и G-clamp с терминальным алкином, подобраны условия синтеза и очистки ОН. Для улучшения эффективности дестабилизации G4 синтезировано два азида для пост-синтетической модификации ОН с помощью “клик”-реакции. Были апробированы две тест-системы для оценки эффективности трансляции: 1) на основе трансфекции in vitro транскрибированной, кэпированной и полиаденилированной мРНК, кодирующей люциферазу и содержащей исследуемый 5'-НТО; 2) на основе двойного люциферазного теста с трансфекцией плазмид и контролем уровня мРНК кПЦР. С помощью первой системы было установлено, что rG4 в 5'-НТО двух терапевтически релевантных мРНК CDK12 и Bcl2 ингибируют трансляцию на 30% и 40% по сравнению с не образующими rG4 мутантами соответственно. В рамках исследования вторичной структуры регуляторных элементов в 5'-НТО мРНК DDX23 была определена структура соответствующих РНК фрагментов методами тиофлавинового теста и УФ-, КД- и ЯМР-спектроскопии. Только один из них был способен образовывать rG4, однако в небольшой доле в равновесии с превалирующей шпилькой, т.е. регуляторным элементом может выступать образуемая данным РНК фрагментом шпилька, а не rG4. Также была исследована структура стабильной шпильки после малой открытой рамки считывания (мОРС), которая с высокой вероятностью может регулировать соотношение эффективности трансляции малой и основной открытой рамки считывания (ОРС). G4-стабилизатор пиридостатин не оказывал влияния на эффективность трансляции мРНК DDX23, следовательно, в ее 5'-НТО нет регуляторных rG4, вопреки ранее опубликованным данным. Для выявленных и охарактеризованных шпилек, способных выступать регуляторами трансляции, был проведен дизайн и синтезированы LNA-модифицированные ОН, направленных на их разрушение. Второй этап исследовательского проекта был сфокусирован на разработке масштабируемой методологии прямой химической модификации 3'-концевого участка мРНК. Предложенный подход основан на двухстадийном процессе: периодатном окислении 3'-концевого рибозного кольца с образованием диальдегидной группы и последующем восстановительном аминировании при взаимодействии с ОН, содержащими 5'-этилендиаминовую (EDA) группу. Предполагается, что такая модификация мРНК способна значительно повысить её стабильность и увеличить время жизни в клетке, что может обеспечить повышение эффективности продукции целевого белка на одну молекулу мРНК. Практическая значимость данного подхода заключается в возможности снижения терапевтических доз мРНК-препаратов, кодирующих различные биологически активные молекулы, включая факторы роста, антитела и гормоны. Успешно реализованы синтетические схемы получения двух 5'-EDA-модифицированных фосфорамидитов для их последующего включения в ОН. Оптимизированы условия синтеза и очистки 5'-EDA-модифицированных ОН. Проведена первичная экспериментальная оценка эффективности конъюгации мРНК с 3'-флуоресцентно меченным 5'-EDA-модифицированным ОН, содержащим остатки 2'-OMe рибонуклеотидов. Полученные результаты создают основу для дальнейшей разработки терапевтических подходов, направленных на повышение экспрессии белков при различных заболеваниях.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Трансляция мРНК - это один из ключевых и строго регулируемых этапов экспрессии генов. 5'-Нетранслируемая область (5'-НТО) мРНК играет ключевую роль в контроле рекрутмента рибосом и часто содержит вторичные структуры, влияющие на эффективность трансляции. В процессе выполнения проекта мы оценили вероятность образования и функциональную роль стабильных вторичных структур в 5'-НТО мРНК гена DDX23, кодирующего DEAD-box хеликазу, играющую важную роль в сплайсинге и расплетении R-петель. Кроме того, мы оценили потенциал данных структур в качестве мишеней для антисмысловых олигонуклеотидов (АСО). Хотя биоинформатические предсказания и транскриптомные данные указывали на возможное образование РНК G-квадруплексов (rG4), детальное исследование с привлечением большого количества биофизических методов, таких как тест с флуоресцентным зондом, круговой дихроизм, УФ-плавление и ЯМР-спектроскопия, показало, что большинство последовательностей-кандидатов не образуют стабильных rG4. Было установлено, что только одна из изучаемых последовательностей находится в динамическом равновесии между rG4 и конкурирующей (вероятно, шпилечной) структурой. Функциональные тесты с использованием репортерного белка в присутствии стандартного стабилизатора G4 дополнительно исключили какую-либо регуляторную роль rG4 в трансляции мРНК DDX23. Вместо этого мы идентифицировали и всесторонне охарактеризовали стабильную шпилечную структуру с высоким регуляторным потенциалом. На основании полученных данных, мы провели дизайн АСО, полностью модифицированных звеньями конформационно запертых нуклеиновых кислот (LNA), которые нацелены на идентифицированную шпильку и на последовательности, окружающие вышележащую открытую рамку считывания (uORF) или старт-кодон основной открытой рамки считывания. Эксперименты с люциферазным репортером показали, что АСО, связывающиеся вблизи 5'-кэпа, обеспечивают значительное подавление трансляции (до ~80%), тогда как АСО, нацеленный на 3`-сегмент эффективно транслируемой uORF, был неэффективен. Последнее вероятно связано с блокировкой рибосомой доступа к данному сегменту. Полученные результаты обеспечивают важными принципами для разработки АСО, модулирующих эффективность трансляции: (1) необходимо избегать последовательностей, которые блокируются активной трансляцией uORF, и (2) точно регулировать стабильность дуплекса АСО–фрагмент мРНК, чтобы не создавать структуры более стабильные, чем эндогенные и, таким образом, больше ингибирующие трансляцию. Работа проясняет механизмы, контролирующие экспрессию DDX23, и может стать основой для разработки терапевтических агентов на основе нуклеиновых кислот для борьбы с глиомами (Brain, 2015, 138, 2553–2570) и немелкоклеточным раком легких (Oncotarget, 2017, 8, 38937-38949). Результаты исследования опубликованы в журнале International Journal of Molecular Sciences (https://www.mdpi.com/1422-0067/26/22/11047).