Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В результате выполнения проекта в 2024 году получены 3 генетически модифицированные линии, изогенные линии FH 1.3.1 от пациента с СГХС, являющегося компаундной гетерозиготой по патогенному и вероятно патогенному аллельным вариантам гена LDLR (с.530С>T/с.1054T>C). Для исправления однонуклеотидных замен использован метод редактирования оснований. Коррекция аллельных вариантов гена LDLR проводилась с помощью двухкомпонентной системы плазмид: созданной нами в рамках данной работы плазмиды pC9-sgRNA-mCherry со встроенными спейсерами направляющих РНК и плазмид-редакторов оснований xCas9(3.7)-ABE(7.10) (addgene # 108382), xCas9(3.7)-BE4 (addgene # 108381). В полученной генетически модифицированной линии 130 S5 произошла коррекция патогенного аллельного варианта с.530С>T до референсного с.530С. В линиях 30S4 и 125S5 гетерозиготная позиция с.530С/Т изменена на позицию с.530T, соответствующую патогенному аллельному варианту гена LDLR. Все три изогенные генетически модифицированные линии демонстрируют свойства плюрипотентности (экспрессия транскрипционных факторов OCT4, NANOG, SOX2, поверхностного антигена SSEA-4), нормальный кариотип, способность дифференцироваться в производные трех зародышевых листков. Анализ коротких тандемных повторов продемонстрировал полное соответствие трех полученных линий ИПСК исходной изогенной линии FH 1.3.1 и мононуклеарным клеткам пациента по 26 полиморфным локусам. Линия ИПСК 130 S5 со скорректированной до референсной позицией с.530С паспортизована и зарегистрирована в Европейском реестре плюрипотентных стволовых клеток hPSCreg под названием ICGi036-A-1 (учетная запись в реестре https://hpscreg.eu/cell-line/ICGi036-A-1). В полученной генетически модифицированной изогенной линии 130 S5 продемонстрировано функциональное подтверждение коррекции патогенного аллельного варианта LDLR в позиции с.530: повышение количества зрелой формы белка LDLR и восстановление способности к интернализации ЛПНП.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В ходе выполнения первой задачи 2025 года каждая из полученных генетически модифицированных линий ИПСК дифференцирована в эндотелиальные производные. В результате данной работы впервые получены эндотелиальные производные генетически модифицированных изогенных линий ИПСК пациентов с СГХС. Эффективность эндотелиальной дифференцировки генетически модифицированных ИПСК, оцененная по количественному содержанию маркера зрелых эндотелиоцитов CD31 по завершении дифференцировки, достоверно не отличается от изогенного контроля. Кроме того, эндотелиальные производные полученных генетически модифицированных ИПСК не отличаются по функциональным маркерам от эндотелиоцитов, полученных от исходной изогенной линии ИПСК пациента с СГХС и линии ИПСК здорового донора. Генетическая модификация также не повлияла на способность образовывать сосудоподобные структуры. Полученные нами линии не отличаются от исходной ни по одному из показателей ангиогенного теста, хотя обнаружены достоверные различия между полученными «больными» и «здоровыми» структурами, что можно объяснить вероятной дисфункцией эндотелия при СГХС. Обнаруженные различия в показателях ангиогенного потенциала эндотелиоцитов, полученных из «здоровой» линии ИПСК, и генетически модифицированных «больных» свидетельствуют о вариабельности в связи с разным генетическим фоном. Это является наглядным примером необходимости использования изогенных линий. Ключевой функциональной характеристикой работы рецептора LDLR является интернализация (захват) ЛПНП. Ранее в лаборатории было показано, что эндотелиальные производные ИПСК больных с СГХС имеют достоверно сниженную способность к интернализации меченой формы ЛПНП (Zakharova et al., 2024). В результате выполнения первой задачи проекта впервые продемонстрированы отличия способности к интернализации ЛПНП в системе изогенных линий на клеточных моделях СГХС. Оказалось, что эндотелиоциты генетически модифицированных линий 30S4, 125S5 и 130S5 демонстрируют достоверные различия интенсивности флуоресценции при захвате ЛПНП по сравнению с эндотелиоцитами исходной изогенной линии FH 1.3.1. Эндотелиальные производные линии 130S5 восстанавливают способность к интернализации ЛПНП, о чем свидетельствует достоверно повышенный по сравнению с изогенным контролем уровень флуоресценции интернализованного меченного ЛПНП. Это говорит о восстановлении функционирования рецептора LDLR в связи с коррекцией последовательности LDLR до «здорового» аллельного варианта с.530С. В эндотелиальных производных линий 30S4 и 125S5 выявлена достоверно сниженная способность к интернализации ЛПНП, что связано с генетической модификацией до гомозиготного состояния по патогенному аллельному варианту с.530С>T и, следовательно, с усугублением нарушения функционирования рецептора LDLR. Таким образом, в полученных генетически модифицированных изогенных клеточных моделях проведено функциональное подтверждение коррекции патогенного аллельного варианта LDLR в позиции с.530. Моделирование клеточного стресса путем обработки окисленной формой липопротеинов низкой плотности показало, что эндотелиальные клетки активируют ряд компенсаторных сигнальных путей в вовлечением генов ABCB1 и CACLRL. При этом активация пути Jak/STAT через STAT1 обнаруживается только для клеток с исходным нескорректированным генотипом LDLR c.530C>T/c.1054T>C.