Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Полигидроксилированные фуллерены (фуллеренолы) С60(ОН)n являются наиболее перспективными аллотропами углерода благодаря гидрофильности, стабильности, низкой токсичности. Целью проекта является оценка иммуносовместимости гидроксилированного фуллерена C60(ОН)22-24 с основными эффекторами врожденного и адаптивного иммунитета. Учитывая тот факт, что биосовместимость наночастиц определяется множеством факторов, таких как концентрация и время воздействия, размер, поверхностный заряд и способность образовывать белковую корону, в работе учитывались данные факторы. В первый год проекта были детально охарактеризованы наночастицы фуллеренола. В работе использовли фуллеренол (MST-WS60-Bio (fullerenol C60(0H)24 99,99%), «Modern Syntesis Technology», Латвия. ИК-спектр подтвердил, что спектральные линии соответствуют полигидроксилированным фуллеренам, ТГМ/ДСК анализ показал, что распад фуллеренола происходит в интервале 70–830 °C, электронный спектр водного раствора продемонстрировал отсутствии непрореагировавшего исходного фуллерена в исследуемом образце. Суспензия (при концентрации 10 мг/мл) имела монодисперсный характер со средним размером агрегатов 130 нм. Дзета-потенциал равен 34,44 мВ, анализ спектров методом ЯМР 1H, 13C показал отсутствие органических примесей. При изучении белковой короны установлено, что белки пулированной сыворотки крови более интенсивно сорбировались на наночастицы/нанокластеры фуллеренола, чем белки ЭТС. Установлено, что уровень эндотоксина в рабочей суспензии фуллеренола был менее 0,01 EU/мл (0,006 EU/мл). Нами подтверждена ярко выраженная антиоксидантная активность фуллеренола C60(OH)22-24. Благодаря использованию в исследовании стандартных антиоксидантов (Trolox и аскорбиновой кислоты) значение антиоксидантной активности исследованного фуллеренола можно сравнить с активностью иных наночастиц и антиоксидантов, описанных в литературе. В отличие от Trolox и аскорбиновой кислоты фуллеренол показал более медленную динамику реакции с DPPH. Эта особенность может быть положительным фактором при его использовании как антиоксиданта в медицине, поскольку за счет более медленного протекания реакции окисления он может обеспечить более длительную защиту от активных форм кислорода. В нашем проекте, под иммуносовместимостью мы подразумеваем отсутствие выраженных негативных эффектов на функциональную активность и дифференцировку основных субпопуляций клеток врожденного и адаптивного иммунитета. Исследования иммуносовместимости фуллеренола были проведены на клетках периферической крови человека, в экспериментах использовали фуллеренол в концентрациях 200, 100, 50, 25, 12,5, 5, 2,5, 0,5 и 0,25 мкг/мл. Контролем служили лунки без добавления наночастиц. Клетки инкубировали в присутствии фуллеренола в течение 24, 48 и 72 часов во влажной атмосфере CO2-инкубатора (5% СO2, 37 ⁰C). Оценивали жизнеспособность нейтрофилов (CD66b+), моноцитов (CD14+), NK-клеток (CD56+), Т-лимфоцитов (CD3+) и B-лимфоцитов (CD19+), а также интернализацию фуллеренола в клетки с применением проточной цитометрии. Помимо этого оценивали продукцию активных форм кислорода методом хемилюминесценции с люминолом и люцигенином. Кроме того, цитотоксический эффект фуллеренола изучали с применением спектрофотометрического метода детекции утечки лактатдегидрогеназы (ЛДГ). В первый год проекта мы установили, что фуллеренол снижает жизнеспособность нейтрофилов только в концентрации 200 мкг/мл, меньшие же его концентрации на всех сроках культивирования не оказывают цитотоксического эффекта эти клетки. Фуллеренол интернализовался нейтрофилами при краткосрочной (30 минут) и при долговременой (24, 48 и 72 ч) инкубации с фуллеренолом, при этом низкие концентрации фуллеренола (12,5, 5, 2,5, 0,5 и 0,25 мкг/м) поглощались не более, чем более, чем 10% клеток на 72 ч наблюдения, в то время как в концентрации 200 мкг/мл процент живых клеток, которые его интернализовали достигал 50%. Показано, что фуллеренол способен модулировать фагоцитоз E.coli К12 FITC+ нейтрофилами, усиливая его в концентрации 200 мкг/мл. Показано, что фуллеренол в концентрациях 0,25; 0,5; 2,5; 5; 12,5 и 25 мкг/мл не влияет на продукцию суммарного пула АФК, а также супероксид-аниона нейтрофилами периферической крови человека. Однако, высокие концентрации наночастиц фуллеренола (50, 100, 200 мкг/мл) способны снижать детекцию АФК исследуемыми клетками, демонстрируя антиоксидантный эффект. Мы продемонстрировали, что высокие концентрации фуллеренола способны оказывать цитотоксический эффект на моноциты при длительном культивировании. Моноциты активно интернализируют наночастицы фуллеренола, при этом мы зафиксировали поглощение фуллеренола моноцитами даже в низких концентрациях (5, 12.5, 25 мкг/мл) в отличие от нейтрофилов. Мы зафиксировали прямую зависимость от времени инкубации и концентрации фуллеренола. В результате исследований показано, что наночастицы фуллеренола не обладают цитотоксичностью в отношении NK-клеток, а также практически не интернализуются в эти клетки в относительно низких концентрациях. Однако, NK-клетки интернализуют фуллеренол в больших концентрациях (100 и 200 мкг/мл), причём процент клеток, интернализовавших фуллеренол возрастает с увеличением продолжительности культивирования и концентрации наночастиц. При изучении иммуносовместимости наночастиц фуллеренола с Т- и В-клетками показано, что в присутствии фуллеренола в высоких концентрациях Т-лимфоциты повышали свою жизнеспособность на 72 ч наблюдения, не влияя на жизнеспособность В-клеток. Установлено, что наночастицы фуллеренола интернализируются в Т- и В-лимфоциты, при этом PC7-клеток возрастал в зависимости от зависимости от времени взаимодействия с фуллеренолом. В целом, В-клетки более активно интернализовали фуллеренол, чем Т-лимфоциты. Таким образом, мы впервые продемонстрировали интернализацию высоких концентраций фуллеренола клетками иммунной системы человека (нейтрофилы, моноциты, NK-клетки, Т-клетки, В-клетки) в системе in vitro. В целом, при исследовании взаимодействия фуллеренола с клетками иммунной системы установлено, что низкие концентрации фуллеренола практически не оказывают модулирующего действия на жизнеспособность клеток, при этом высокие концентрации фуллеренола (100, 200 мкг/мл) оказывали цитотоксический эффект на исследуемые популяции клеток врожденного иммунитета. Полученные результаты содержат новые сведения об иммуносовместимости перспективного аллотропа углерода фуллеренола С60(ОН)22-24, что имеет значения для создания новых средств терапии и диагностики на основе данных наночастиц.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Фуллеренолы — полигидроксилированные производные фуллерена (C 60 (OH) n ), обладающие антиоксидантными, противовирусными и антибактериальными свойствами и потенциально пригодные для биомедицинского применения благодаря своей растворимости и биосовместимости. Во второй год проекта изучалось воздействие фуллеренола C60(OH) 24 (MST-Nano, Санкт-Петербург, Россия) на различные типы иммунных клеток человека in vitro. Эксперименты проводились с использованием нормальных клеток периферической крови (мононуклеары (PBMC), моноциты, нейтрофилы) и опухолевой клеточной линии (THP-1). Ключевые параметры включали апоптоз, фагоцитоз, дифференцировку, метаболизм клеток и продукцию цитокинов (TNF-α, IL-8). Концентрации фуллеренола варьировались от 0,25 до 1000 мкг/мл, время экспозиции от 2 часов до 24–72 ч для разных субпопуляций клеток. Установлено, что эффекты фуллеренола на клетки линии THP-1 зависят от концентрации и времени воздействия. Через 24 часа 750 мкг/мл увеличивали жизнеспособность, тогда как 1000 мкг/мл индуцировали апоптоз. Через 48 и 72 часа апоптоз усиливался при концентрациях ≥750 мкг/мл, со снижением жизнеспособности. Ассоциация наночастиц коррелировала с концентрацией и обратно коррелировала с жизнеспособностью, но не зависела от времени инкубации. Метаболический анализ выявил снижение гликолиза при концентрации 750 мкг/мл. Показано, что фуллеренол усиливал продукцию TNF-α клетками при высоких концентрациях, одновременно уменьшая уровень IL-8. В целом, наше исследование показало, что наночастицы фуллеренола безопасны для моноцитарной клеточной линии THP-1 в концентрации до 500 мкг/мл. Установлено, что в схеме дифференцировки THP-1 в макрофаги М1 был обнаружен эффект снижения экспрессии практически всех целевых молекул на поверхности клеток, начиная с низких концентраций фуллеренола - 2,5 мкг/мл (HLA-DR), а в случае с другими маркерами (CD14, CD11b) - при более высоких концентрациях. По-видимому, учитывая сохранение жизнепособности клеток, данный эффект связан с экранированием маркерных молекул для детектирующих антител, что нуждается в прицельном изучении. В экспериментах на изолированных моноцитах (CD14+) статистически значимое снижение жизнеспособности наблюдалось уже через 24 часа после начала культивирования в культурах с 200 мкг/мл фуллеренола. Кроме того, фуллеренол в концентрациях 100 и 200 мкг/мл обладал проапоптотическим действием в отношении изолированных моноцитов. Концентрация фуллеренола 100 мкг/мл увеличивала процент этих клеток только в 72-часовых культурах, тогда как концентрация 200 мкг/мл во все сроки культивирования. Как и в предыдущих экспериментах, фуллеренол адгезировался/поглощался клетками, причем достоверные отличия процента флуоресцирующих в PC7-канале клеток от контроля наблюдались начиная с 2 часов инкубации с фуллеренолом в концентрациях 25, 50, 100 и 200 мкг/мл. Показано, что фуллеренол стимулирует синтез TNF-α и одновременно уменьшает секрецию IL-8 при длительном контакте. Показано, что при взаимодействии с фуллеренолом в моноцитах возрастает активность гликолиза. В целом, нормальные моноциты человека были более чувствительны к воздействию фуллеренола. Изучали взаимодействие фуллеренола С60(ОН) 22-24 с мононуклеарными клетками человека в системе прижизненного наблюдения Cell-IQ. Показано, что после 72 ч инкубации высокие концентрация фуллеренола С60(OH)22-24 (25, 50, 100 мкг/мл) стимулировали прирост клеточной массы, однако сверхвысокие концентрации (750, 1000 мкг/мл) снижали этот параметр. Сверхвысокие концентрации фуллеренола С60(OH)22-24 (750, 1000 мкг/мл) снижали жизнеспособность, и повышали уровень апоптоза, а также число мертвых клеток в культурах мононуклеарных клеток. Таким образом, фуллеренол в концентрациях 2,5, 25, 50, 100 и 250 мкг/мл не оказывал цитотоксических эффектов на мононуклеарные клетки, демонстрируя тенденцию к стимуляции прироста клеточной массы, а также не изменяет визуальные параметры клеток в системе прижизненного мониторирования CELL-IQ. В то же время, высокие концентрации фуллеренола демонстрировали цитотоксические эффекты. В отношении нейтрофилов было установлено, что проапоптотическое действие фуллеренола в отношении этих короткоживущих клеток крови начинает проявляться уже через 24 часа, начиная с концентрации 50 мкг/мл. В то же время, не обнаружено влияния фуллеренола на поглощение нейтрофилами FITC-меченой E. coli K12, однако, клетки активно адгезировали/поглощали наночастицы фуллеренола (100, 200 мкг/мл). Показано, что фуллеренол в концентрации 50 мкг/мл снижает содержание внутриклеточных активных форм кислорода в стимулированных нейтрофилах. При оценке продукции цитокинов было установлено, что фуллеренол повышал секрецию TNF-α нейтрофилами, не влияя на уровень ИЛ-8. При изучении локализации поглощенного фуллеренола внутри клеток с использованием платформы Cytek ImageStreamX Mk II (Cytek/Amnis) не удалось визуализировать адгезию и/или интернализацию фуллеренола нейтрофилами, что свидетельствует о необходимости искать другой метод. В отношении дендритных клеток (ДК) человека, полученных из периферических моноцитов, установлено, что фуллеренол поглощается/адгезируется в культурах с концентрациями 25-200 мкг/мл наночастиц. Снижение количества зрелых ДК (СD209+CD83+) в культурах обратно коррелирует с увеличением процента фуллеренол-позитивных клеток и в культурах с 50-200 мкг/мл наночастиц стремится к нулю. Таким образом, установлено, фуллеренол вызвал снижение экспрессии маркеров CD209 и CD83, что можно назвать негативным эффектом в отношении дифференцировки ДК. Кроме этого, изучалось влияния наночастиц фуллеренола С60(OH)22-24 на жизнеспособность и дифференцировку Т-регуляторных клеток (Treg) человека in vitro. Установлено, что фуллеренол С60(OH)22-24 в концентрациях 25, 50, 100 и 200 мкг/мл не влиял на жизнеспособность и показатели раннего и позднего апоптоза на уровне общего пула CD4+-клеток, также не обнаружено эффектов на дифференцировку Treg (CD4+CD25+FoxP3+) и продукцию IL-10. Однако, фуллеренол С60(OH)22-24 в концентрациях 100 и 200 мкг/мл демонстрировал адгезию/интернализацию Т-хелперами и Treg. Таким образом, фуллеренол С60(OH)22-24 в предположительных фармакологических концентрациях 25 и 50 мкг/мл не оказывал достоверного влияния на процессы дифференцировки Treg, что свидетельствует о его биосовместимости с данным типом клеток. Таким образом, установлено, что концентрации фуллеренола, потенциально применимые в биомедицине (до 250 мкг/мл) практически не снижали жизнеспособность клеток иммунной системы. В то же время, нормальные клетки иммунной системы человека были более чувствительны к воздействию фуллеренола, в сравнении с патологически измененной клеточной линией THP-1.