Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В отчетном году в рамках проекта были достигнуты значимые научные результаты, а именно выделение и описание первых микобактериофагов из России, обладающих активностью в отношении микобактерий. Основное внимание было сосредоточено на отработке методик работы с микобактериофагами, формировании коллекции фагов, их геномной характеристике, исследовании спектра хозяев и анализе жизненного цикла лидерных фагов. В рамках выполнения проекта была создана коллекция из 24 микобактериофагов, выделенных из образцов, собранных на территории Москвы и Подмосковья. Для выделения фагов применялся модельный организм Mycobacterium smegmatis mc2 155; в ходе работ была оптимизирована методика накопительных культур. Титр фагов варьировал от 10^8 до 10^10 БОЕ/мл. На бактериальном газоне фаги образовывали зоны лизиса различной морфологии и размеров, что свидетельствовало об их принадлежности к разным таксономическим кластерам. Важным этапом работы стало полногеномное секвенирование и аннотация геномов 24 микобактериофагов, что позволило провести их таксономическую классификацию и оценить генетическое разнообразие. В результате филогенетического анализа и геномной кластеризации 21 уникального фага установлено, что 6 фагов принадлежат к кластеру A (все фаги относятся к субкластеру A3), 6 фагов — к кластеру B (2 фага из субкластера B1 и 4 из B2), 4 фага — к кластеру F (3 фага F1 и 1 фаг, предположительно относящийся к новому субкластеру), 2 фага — к кластеру S и 1 фаг — к кластеру Y. Один из фагов — M1(Arbat) — продемонстрировал уникальные генетические особенности, не позволяющие отнести его к известным кластерам. Данный фаг был классифицирован как "синглтон", то есть уникальный фаг, не относящийся ни к одному из известных кластеров. Геном M1(Arbat) имел длину 108,9 тыс. пар оснований, что является нетипичным для микобактериофагов и подчеркивает особое положение данного фага. В его геноме было обнаружено 195 открытых рамок считывания (ORF), 22 гена тРНК и большое количество белков с неизвестной функцией. Особое внимание было уделено фагам кластера A, выделенным из образцов со схожей локацией, что предполагает их микроэволюцию. Длина их геномов варьировала от 45 до 48 т.п.н., за исключением фага G2-b (51,4 т.п.н.). Эти фаги были короче большинства фагов кластера A (49–53 т.п.н.), что может свидетельствовать о делециях. Только G1-d, G2-b и Sheep сохранили модуль интеграции, включающий транскрипционный репрессор и интегразу. Для фага Cat выявлена делеция участка, содержащего репрессор, что аналогично утрате репрессора у D29. У фага KV обнаружена утрата гена интегразы при сохранении репрессора. Важное место в работе заняло изучение спектра хозяев микобактериофагов. Тестирование активности 21 фага на референсном штамме Mycobacterium tuberculosis H37Rv показало, что 8 фагов продемонстрировали способность лизировать данный штамм, включая 5 фагов из кластера A, 1 фаг из кластера K и 1 фаг из кластера Y. Фаг Vic9 (B2) проявил слабую активность только при высоких титрах (EOP=2×10^(-5)). Дополнительно было протестировано 18 клинических штаммов M. tuberculosis, включая штаммы линий 2 и 4 (Beijing B0/W148, Clade A, CAO, LAM, Ural), в том числе лекарственно-устойчивые изоляты. Результаты показали, что активность фагов на клинических штаммах M. tuberculosis практически не отличается от их активности против референсного штамма H37Rv. Тем не менее, тестирование активности на M. abscessus, M. fortuitum и M. avium показало, что выделенные бактериофаги либо не действуют на штаммы, либо приводят к лизису только в больших титрах. На основании результатов был сформирован список лидерных бактериофагов (Vic9, 3Ga (YasnayaPolyana) и Cat), для которых были проанализированы дополнительные показатели. Оптимальное значение MOI для всех трех фагов составило 0,01. Максимальный выход фаговых частиц достигал 10^9 БОЕ/мл. Установлено, что латентный период для фагов 3Ga и Cat составляет 60 минут, а для Vic9 — 90 минут. Период активного роста длился 60 минут у фага Cat и 150 минут у фагов Vic9 и 3Ga (YasnayaPolyana). Наибольший выход фаговых частиц был зарегистрирован у фага Cat (110 БОЕ на клетку), что делает его перспективным кандидатом для дальнейших исследований. Для фага Vic9, как и в целом для представителей субкластера B2, соответствующие параметры жизненного цикла были установлены впервые в мире. Исследование устойчивости фагов к экстремальным условиям показало, что они стабильны в диапазоне температур от -20°C до 45°C. Однако при 55°C наблюдается снижение титра фагов на порядок. Все три фага сохраняли жизнеспособность в диапазоне рН 6-12, но при рН ниже 6 фаги Vic9 и 3Ga полностью теряли жизнеспособность, тогда как фаг Cat демонстрировал умеренное снижение титра. Также в ходе работы был разработан и оптимизирован метод концентрирования бактериофагов с использованием ультрацентрифугирования. Применение данной методики позволило увеличить количество жизнеспособных фагов в растворе на 2,5-3 порядка и получать стерильные препараты с титром до 10^12 БОЕ/мл. Полученные данные стали основой для научной публикации. Результаты исследования фага Vic9 были приняты к публикации в журнале Frontiers in Microbiology "Vic9 Mycobacteriophage: The First Subcluster B2 Phage Isolated in Russia". В статье описываются особенности строения, морфологии и жизненного цикла фага Vic9, генетической организации бактериофага. Также результаты проекта были представлены на трех научных конференциях. В рамках мероприятий продемонстрированы уникальные подходы к выделению и анализу микобактериофагов, а также обсуждены возможности их применения для разработки новых антимикобактериальных средств.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В ходе исследований выделено три новых микобактериофага: Ground-B, Duck2 и Ground-D. На основе полногеномного секвенирования (Illumina) установлена их таксономическая принадлежность к субкластерам K4, M1 и P1 соответственно. Все изоляты по морфологии (ТЭМ) относятся к сифовирусам с характерной для их кластеров длиной хвоста. Также был продолжен анализ лидерного фага Yasnaya_Polyana (субкластер K4), выбранного в рамках реализации первого этапа Проекта. Масштабный сравнительный биоинформатический анализ его регуляторных геномных мотивов выявил уникальные черты и значительную дивергенцию, что углубляет фундаментальное понимание эволюции этой группы вирусов. Также на основе фага с использование технологии BRED было создано литическое производное YPΔ47 путем направленной делеции гена репрессора. Мутант утратил способность к лизогении (0,0096% против 18% у фага дикого типа). YPΔ47 продемонстрировал повышенную на порядок эффективность посева (EOP) на M. tuberculosis H37Rv и широкий спектр литической активности в отношении клинических изолятов M. tuberculosis, включая штаммы с множественной лекарственной устойчивостью и относящиеся к разным филогенетическим линиям (L1, L2, L4). Для комплексного изучения взаимодействия фага с клеткой-хозяином был проведён сравнительный транскриптомный и протеомный анализ ответа M. smegmatis на инфекцию фагами Yasnaya_Polyana и YPΔ47 (MOI=3). Пробы для анализа отбирали в раннюю (30 минут) и позднюю (130 минут) временные точки после адсорбции. Для протеомного исследования использовали пробы из поздней точки. В результате протеомного анализа идентифицировано более 3600 белков, из которых 305 достоверно изменяли свой уровень в ответ на инфекцию. Изменения в 79 белках были общими для обоих фагов и отражали общий адаптационный стрессовый ответ (подавление метаболизма, активация детоксикации и транспорта). При этом выявлены качественные различия: при лизогенной инфекции специфически накапливались фаговые белки интеграции и регуляции, а ответ клетки носил черты адаптивной перестройки, тогда как литическая инфекция запускала острый стресс с индукцией ферментов детоксикации и одновременным снижением уровня белков, участвующих в биосинтезе аминокислот, клеточной стенки и энергетическом метаболизме. Для оценки реального терапевтического потенциала YPΔ47 была проведена серия экспериментов на различных моделях. На культурах M. smegmatis и M. tuberculosis в логарифмической фазе роста подтверждена его исключительная активность, приводящая к полной элиминации бактерий. Фаг Yasnaya_Polyana снижал количество на несколько порядков, но ни в одном из случаев не приводил к полной элиминации бактерий. Критически важным стал анализ зависимости эффективности от физиологического состояния бактерий. Установлено, что эффективность фага напрямую коррелирует с метаболической активностью клеток-хозяев: в то время как против активно делящихся клеток эффект максимален, против стационарных — значительно снижен, а против покоящихся форм, полученных в моделирующих средах, статистически значимой активности не выявлено. Показано, что одним из ключевых ограничивающих факторов является нарушение адсорбции фага на нереплицирующиеся клетки. Отдельным комплексным направлением стала оценка способности фагов воздействовать на внутриклеточные формы M. tuberculosis в модели инфицированных макрофагов линии RAW 264.7. Оба бактериофага (Yasnaya_Polyana и YPΔ47) практически не оказывали эффекта. что находится в русле противоречивых результатов мировой литературы, подчеркивающих исключительную сложность задачи элиминации бактерий внутри клеток хозяина. В попытке преодолеть этот барьер была успешно освоена комплексная процедура получения липосомальной формы фага, включающая высокоэффективную очистку препарата методом ионно-обменной хроматографии и последующую инкапсуляцию в липосомы на основе фосфатидилхолина и холестерина методом экструзии. В результате получен препарат липосом с инкапсулированным фагом. Однако в условиях экспериментальной модели данный способ доставки не привел к усилению антимикобактериального эффекта, что указывает на необходимость поиска более специфичных носителей. Таким образом, за отчетный период не только расширена ресурсная база (новые изоляты) и получены фундаментальные знания об эволюции регуляторных систем фагов, но и создан перспективный литический агент YPΔ47. Всесторонне охарактеризован его высокий потенциал для терапии активного туберкулеза, включая штаммы с множественной лекарственной устойчивостью, и одновременно выявлены ключевые ограничения, связанные с персистенцией возбудителя и внутриклеточной локализацией. Результаты проекта были представлены на восьми научных конференциях (одна из конференций представлена в СМИ; https://pcr.news/novosti/md-2025-o-tuberkuleze-i-raznoobrazii-mikobakteriy/) и опубликованы в рецензируемом журнале Front. Microbiol. (https://doi.org/10.3389/fmicb.2025.1713073). Научно-популярные материалы о работе широко освещались в СМИ, включая информационный портал «Известия», научно-популярное издание «Индикатор», официальный сайт Российского научного фонда, а также специализированные ресурсы «Фармобразование» и «ГосРФ» (https://pharmedu.ru/publication/novyj-bakteriofag-vic9-mozhet-stat-al-ternativoj-antibiotikam-v-lechenii-tuberkuleza; https://rscf.ru/news/medicine/preparatnyy-resurs-pozhiratel-bakteriy-sovershit-perevorot-v-terapii-tuberkuleza/; https://iz.ru/1846617/mariia-nediuk/pozhiratel-bakterii-sovershit-revoliutciiu-v-lechenii-tuberkuleza; https://indicator.ru/medicine/novyi-bakteriofag-pomozhet-naiti-alternativu-antibiotikam-dlya-lecheniya-tuberkuleza-05-03-2025.htm; https://gosrf.ru/uchenye-otkryli-novyj-mikobakteriofag-vic9-unichtozhayushhij-vozbuditelej-tuberkuleza-i-prokazy; https://onlymainnews.ru/novyj-bakteriofag-vic9-otkryvaet-perspektivy-v-borbe-s-tuberkulezom/).