КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 24-15-00514
НазваниеМикобактериофаги как потенциальные терапевтические агенты в борьбе с туберкулезом
Руководитель Шитиков Егор Александрович, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства" , г Москва
Конкурс №92 - Конкурс 2024 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-403 - Медицинская микробиология и вирусология
Ключевые слова Бактериофаги, Mycobacterium tuberculosis, лекарственная устойчивость, противотуберкулезная терапия, туберкулезная инфекция, полногеномное секвенирование, транскриптомика, протеомика, макрофагальная модель, мышиная модель
Код ГРНТИ76.03.41
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Во всем мире туберкулез, вызываемый микобактериями туберкулезного комплекса, является одной из основных причин смертности населения. Положение усугубляется распространением лекарственно-устойчивых форм, что акцентирует внимание на необходимости разработки альтернативных подходов к терапии.
Одним из таких подходов может стать фаготерапия. Бактериофаги (фаги) доказали высокую эффективность против основных возбудителей внутрибольничных инфекций, причем количество работ по их применению увеличивается из года в год, что подтверждает потенциал направления [Uyttebroek S et al, 2022].
В отношении микобактериальных инфекций достигнуты первые успехи в фаготерапии заболеваний, вызванных нетуберкулезными микобактериями [Dedrick RM et al, 2023; Little JS et al, 2022; Nick JA et al., 2022], однако против Mycobacterium tuberculosis (Mtb) подобная практика не применяется. К числу препятствий относят медленный рост, сложность работы с патогеном и комплексность инфекционного процесса. Тем не менее, пионерские работы с использованием модельных животных показывают перспективные результаты [Carrigy NB et al, 2019; Avdeev V et al, 2023].
В ходе реализации проекта предполагается осуществить поиск бактериофагов и оценить возможность их применения для терапии поражения легких, вызванных Mtb.
На первом этапе будет сформирована коллекция фагов (>20), активных против быстрорастущего модельного микроорганизма M. smegmatis, их геномы будут секвенированы, проведен анализ основных структурных модулей и филогенетический анализ. В связи с частой перекрестной активностью будет исследована способность отобранных фагов заражать Mtb [Hatfull G, 2018]. В работе будет использован референсный штамм Mtb H37Rv, а также штаммы распространенных на территории России генотипов (не менее 20). Литический микобактериофаг D29 будет использован в качестве контроля [Ford et al., 1998]. Для наиболее перспективных фагов будет оценена устойчивость к факторам окружающей среды; установлены основные показатели жизненного цикла; отработана процедура очистки. По результатам работы будет выбран лидерный бактериофаг(и), наиболее подходящий для нужд фаготерапии. В случае отсутствия среди фагов литического, генно-инженерными методами будет осуществлена модификация умеренного фага по технологии BRED [Marinelli et al., 2008].
Следующий этап будет посвящен исследованию взаимодействия «фаг-хозяин» с использованием омиксных технологий, что само по себе является новым направлением. Транскриптомные и протеомные исследования углубят представления о механизме действия фагов, а сравнительный анализ результатов позволит выделить ключевые факторы, регулирующие процессы жизнеобеспечения микобактерий и способы влияния на них. Также будет проведено исследование механизмов формирования устойчивости к фагам и оценка активности отобранных бактериофагов в отношении микобактерий, находящихся в разных физиологических состояниях с различным уровнем метаболической активности.
В дальнейшем будет оценена активность фага(ов) в отношении клеток возбудителя в макрофагальных моделях, что является необходимым в связи с противоречивыми мнениями относительно данного аспекта.
На следующем этапе будет проведена оценка эффективности фаговой терапии на мышиных моделях. Будет подобран способ введения препарата, эффективная лекарственная доза и кратность. Эффект будет оценен по показателям: выживаемость животных и изменение их массы, обсемененность паренхиматозных органов, патоморфологические изменения легких мышей и изменение уровней транскрипции генов цитокинов мышей в ходе инфекции и фаговой терапии.
Таким образом, в ходе проекта будет сформирована уникальная коллекция бактериофагов, специфичная в отношении эндемичных штаммов патогена, а также использован комплексный подход, который позволит выявить бактериофаг(и) с наиболее высоким терапевтическим потенциалом, отвечающие всем необходимым требованиям для успешного применения в качестве противотуберкулезного препарата и последующей регистрации.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В отчетном году в рамках проекта были достигнуты значимые научные результаты, а именно выделение и описание первых микобактериофагов из России, обладающих активностью в отношении микобактерий. Основное внимание было сосредоточено на отработке методик работы с микобактериофагами, формировании коллекции фагов, их геномной характеристике, исследовании спектра хозяев и анализе жизненного цикла лидерных фагов.
В рамках выполнения проекта была создана коллекция из 24 микобактериофагов, выделенных из образцов, собранных на территории Москвы и Подмосковья. Для выделения фагов применялся модельный организм Mycobacterium smegmatis mc2 155; в ходе работ была оптимизирована методика накопительных культур. Титр фагов варьировал от 10^8 до 10^10 БОЕ/мл. На бактериальном газоне фаги образовывали зоны лизиса различной морфологии и размеров, что свидетельствовало об их принадлежности к разным таксономическим кластерам.
Важным этапом работы стало полногеномное секвенирование и аннотация геномов 24 микобактериофагов, что позволило провести их таксономическую классификацию и оценить генетическое разнообразие. В результате филогенетического анализа и геномной кластеризации 21 уникального фага установлено, что 6 фагов принадлежат к кластеру A (все фаги относятся к субкластеру A3), 6 фагов — к кластеру B (2 фага из субкластера B1 и 4 из B2), 4 фага — к кластеру F (3 фага F1 и 1 фаг, предположительно относящийся к новому субкластеру), 2 фага — к кластеру S и 1 фаг — к кластеру Y. Один из фагов — M1(Arbat) — продемонстрировал уникальные генетические особенности, не позволяющие отнести его к известным кластерам. Данный фаг был классифицирован как "синглтон", то есть уникальный фаг, не относящийся ни к одному из известных кластеров. Геном M1(Arbat) имел длину 108,9 тыс. пар оснований, что является нетипичным для микобактериофагов и подчеркивает особое положение данного фага. В его геноме было обнаружено 195 открытых рамок считывания (ORF), 22 гена тРНК и большое количество белков с неизвестной функцией.
Особое внимание было уделено фагам кластера A, выделенным из образцов со схожей локацией, что предполагает их микроэволюцию. Длина их геномов варьировала от 45 до 48 т.п.н., за исключением фага G2-b (51,4 т.п.н.). Эти фаги были короче большинства фагов кластера A (49–53 т.п.н.), что может свидетельствовать о делециях. Только G1-d, G2-b и Sheep сохранили модуль интеграции, включающий транскрипционный репрессор и интегразу. Для фага Cat выявлена делеция участка, содержащего репрессор, что аналогично утрате репрессора у D29. У фага KV обнаружена утрата гена интегразы при сохранении репрессора.
Важное место в работе заняло изучение спектра хозяев микобактериофагов. Тестирование активности 21 фага на референсном штамме Mycobacterium tuberculosis H37Rv показало, что 8 фагов продемонстрировали способность лизировать данный штамм, включая 5 фагов из кластера A, 1 фаг из кластера K и 1 фаг из кластера Y. Фаг Vic9 (B2) проявил слабую активность только при высоких титрах (EOP=2×10^(-5)). Дополнительно было протестировано 18 клинических штаммов M. tuberculosis, включая штаммы линий 2 и 4 (Beijing B0/W148, Clade A, CAO, LAM, Ural), в том числе лекарственно-устойчивые изоляты. Результаты показали, что активность фагов на клинических штаммах M. tuberculosis практически не отличается от их активности против референсного штамма H37Rv. Тем не менее, тестирование активности на M. abscessus, M. fortuitum и M. avium показало, что выделенные бактериофаги либо не действуют на штаммы, либо приводят к лизису только в больших титрах.
На основании результатов был сформирован список лидерных бактериофагов (Vic9, 3Ga (YasnayaPolyana) и Cat), для которых были проанализированы дополнительные показатели. Оптимальное значение MOI для всех трех фагов составило 0,01. Максимальный выход фаговых частиц достигал 10^9 БОЕ/мл. Установлено, что латентный период для фагов 3Ga и Cat составляет 60 минут, а для Vic9 — 90 минут. Период активного роста длился 60 минут у фага Cat и 150 минут у фагов Vic9 и 3Ga (YasnayaPolyana). Наибольший выход фаговых частиц был зарегистрирован у фага Cat (110 БОЕ на клетку), что делает его перспективным кандидатом для дальнейших исследований. Для фага Vic9, как и в целом для представителей субкластера B2, соответствующие параметры жизненного цикла были установлены впервые в мире.
Исследование устойчивости фагов к экстремальным условиям показало, что они стабильны в диапазоне температур от -20°C до 45°C. Однако при 55°C наблюдается снижение титра фагов на порядок. Все три фага сохраняли жизнеспособность в диапазоне рН 6-12, но при рН ниже 6 фаги Vic9 и 3Ga полностью теряли жизнеспособность, тогда как фаг Cat демонстрировал умеренное снижение титра.
Также в ходе работы был разработан и оптимизирован метод концентрирования бактериофагов с использованием ультрацентрифугирования. Применение данной методики позволило увеличить количество жизнеспособных фагов в растворе на 2,5-3 порядка и получать стерильные препараты с титром до 10^12 БОЕ/мл.
Полученные данные стали основой для научной публикации. Результаты исследования фага Vic9 были приняты к публикации в журнале Frontiers in Microbiology "Vic9 Mycobacteriophage: The First Subcluster B2 Phage Isolated in Russia". В статье описываются особенности строения, морфологии и жизненного цикла фага Vic9, генетической организации бактериофага.
Также результаты проекта были представлены на трех научных конференциях. В рамках мероприятий продемонстрированы уникальные подходы к выделению и анализу микобактериофагов, а также обсуждены возможности их применения для разработки новых антимикобактериальных средств.
Публикации
1. Зайчикова М.В., Малахова М.В., Беспятых Д.А., Корниенко М.А., Климина К.М., Строкач А.А., Городничев Р. Б., Герман А.М., Фурсов М.В., Багров Д.В., Внукова А.А., Грачева А.Н., Казюлина А.А., Шлеева М.О., Шитиков Е.А. Vic9 Mycobacteriophage: The First Subcluster B2 Phage Isolated in Russia Frontiers in Microbiology (год публикации - 2025)