Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В 2024 году в исследование было включено 80 реципиентов трансплантированного сердца (ТС), 26 в раннем (от 1 месяц до 1 года) и 54 в позднем (1 год и более) послеоперационном периоде. Всем 80 пациентам были выполнены клиническая оценка состояния; ЭхоКГ (оценка функции миокарда); эндомиокардиальная биопсия (для исключение острого криза клеточного и гуморального отторжения); коронарография (верификация варианта хронического отторжения – болезнь коронарных артерий пересаженного сердца); оценка уровня NT-proBNP, тропонин, наличия антител к HLA антигенам I и II класса (с оценкой донорспецифичности). Произведено биобанкирование образцов периферической крови, плазмы и сыворотки крови, фекалий. Все включенные в исследования 80 реципиентов трансплантированного сердца были распределены по четырем группам: 1 группа: реципиенты ТС в раннем посттрансплантационном периоде - от 1 месяца до 1 года (26 пациентов); 2 группа: реципиенты в период от 1 до 3 лет после ТС (17 пациентов); 3 группа: реципиенты в период от 3 до 5 лет после ТС (15 пациентов); 4 группа: реципиенты после 5 лет от ТС (22 пациента). По данным выполненной эндомиокардиальной биопсии различные варианты отторжения выявлены у 30% пациентов: в 33% случаях - клеточные кризы отторжения и 67% - гуморальные. В данном исследовании проводилось иммунофенотипирование субпопуляций лейкоцитов периферической крови у реципиентов аллогенной трансплантации сердца в раннем и позднем посттрансплантационном периодах. Для выявления основных субпопуляций «поляризованных» Т-хелперов периферической крови применялся разработанная нашей группой панель моноклональных антител против CD45RA, CD62L, CD25, CXCR5 (CD185), CCR6 (CD196), CXCR3 (CD183), CD3, CD4 и CCR4 (CD194), что позволяет изолированно исследовать субпопуляции Т-хелперов центральной памяти, эффекторной памяти, «терминально-дифференцированные» CD45RA-позитивные эффекторные Т-хелперы и наивные клетки. Кроме того, оценивался уровень Th1, Th2, Th17 лимфоцитов, а также фолликулярных Т-хелперов. Для анализа субпопуляционного состава Tfh был использован подход, основанный на оценке наличия или отсутствии на поверхности клетки хемокиновых рецепторов CXCR3 и CCR6. Были выделены следующие субпопуляции циркулирующих Tfh, включая Tfh1, Tfh2, Tfh17 и DP Tfh. Кроме того, в рамках общего пула Т-клеток выявляли регуляторные Т-клетки (Tregs), «наивные» Tregs, а также Tregs центральной и эффекторной памяти. Окраска антителами против IgD и CD38 позволяла выделить следующие субпопуляции В-клеток: “наивные” Bm1 клетки, “активированные наивные” Bm2 клетки, Bm2’ – клетки-предшественники герминального центра, общая субпопуляция, включающая в себя центробласты и центроциты – так называемые “Bm3+Bm4” клетки, клетки ранней памяти eBm5 и покоящиеся клетки памяти Bm5. Для более точного выявления циркулирующих предшественников плазматических клеток (плазмобластов) был применен алгоритм анализа, основанный на оценке уровней экспрессии CD38 и CD27. У 75 реципиентов трансплантированного сердца (ТС) в раннем (21 пациент до 1 года) и позднем (32 пациента от 1 до 5 лет после ТС; 22 пациента более 5 лет после ТС) посттрансплантационном периоде в образцах плазмы крови определен уровень 47 цитокинов. Проведенный дискриминантный анализ показал, что пациенты в раннем посттрансплантационном периоде с подтвержденным отторжением на основе данных эндомиокардиальной биопсии формируют четкий обособленный кластер по сравнению с пациентами без отторжения, пациентами с ХСН и здоровыми добровольцами, что подтверждалось 100% точностью прогнозирования для обеих групп пациентов после ТС (с отторжением и без) согласно матрице классификации. Наиболее сильными дискриминирующими факторами оказались M-CSF, MDC, EGF, IL-18 и TNFα. В позднем (более 5 лет) посттрансплантационном периоде все три группы реципиентов, в частности, с подтвержденным отторжением на основе данных эндомиокардиальной биопсии (G1:31), без отторжения (G_2:61) и пациенты с БКАПС (G_3:11), по результатам дискриминантного анализа распределялись в три четких обособленных кластера. Высокая степень дискриминации была установлена для 27 из 47 исследованных цитокинов/хемокинов/факторов роста. Наиболее сильными дискриминирующими факторами оказались IL-15, MCP-1, EGF, IL-12(p40), VEGF-A, MIP-1α, IL-18, IL-13. Начато исследование профиля циркулирующих в плазме внеклеточных везикул, для чего был использован набор Exosome kit Macs Plex EVkit IO, human. По валидированному протоколу проведено иммунофенотипирование 81 образца плазмы крови реципиентов донорского сердца на разных сроках после проведенной операции с неосложненным посттрансплантационным периодом и с признаками клеточного и гуморального отторжения, а также БКАПС. В этих же образцах плазмы крови проведено изучение размерности и концентрации циркулирующих внеклеточных везикул плазмы крови на приборе Nanosight 3000. На основании данных литературы и имеющихся баз данных с использованием ключевым слов (mi-RNAs, transplanted heart, allograft rejection, small non-coding RNAs, inflammation) были проанализированы и подобраны целевые микроРНК в качестве кандидатных биомаркеров отторжения трансплантированного сердца: miR-10a, miR-92a, miR-155, miR-223-3р, miR-326. Был разработан дизайн исследования профиля малых некодирующих РНК в плазме крови реципиентов сердца с учетом длительности посттрансплантационного периода. Всего в исследование включено 30 реципиентов сердца: 5 реципиентов (4 с отторжением и 1 без отторжения) в раннем посттрансплантационном периоде от 1 месяца до 1 года; 14 реципиентов (6 с отторжением и 8 без отторжения) в позднем посттрансплантационном периоде от 1 до 5 лет; а также 5 реципиентов с БКАПС в период от 1 года до 5 лет после трансплантации и 3 реципиента с БКАПС давностью более 5 лет после трансплантации. Из каждого образца плазмы крови выделена тотальная РНК для последующего проведения РНК-секвенирование короткоцепочечных РНК.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В 2025 году продолжен набор пациентов во все исследуемые группы. В сформированную базу данных внесены результаты, включая рутинные клинико-лабораторные, инструментальные и эхокардиографические показатели, а также результаты эндомиокардиальной биопсии и коронарографии — всего 256 атрибутов. Был начат анализ субпопуляционного состава В-лимфоцитов с применением разных алгоритмов фенотипирования. Применение первого алгоритма позволило выявить значимые отличия в уровнях субпопуляций Bm1 (p=0.025) и Bm2 (p=0.011). В частности, уровень клеток Bm2 у пациентов с AMR составил 7.31% (2.80; 13.03), что значительно превышало аналогичные показатели у пациентов с CAV (2.59% (0.92; 3.20), p=0.012). Второй алгоритм анализа показал достоверные различия в уровнях наивных IgD+CD27- В-лимфоцитов (p=0.025) и клеток памяти с "не переключенным" классом синтезируемых антител IgD+CD27+ (p=0.021). Так, уровень наивных клеток оказался различным у пациентов с AMR (7.73% (2.69; 14.19)) в сравнении с CAV (2.83% (1.08; 3.61), p=0.032). Также значения IgD+CD27+ клеток отличались (p=0.018) у пациентов с CAV (0.27% (0.09; 0.81)) и тех, у кого реакции отторжения не выявлены (R0) (1.22% (0.47; 2.19)). Следующий алгоритм выявил значительные различия между группами пациентов по уровням зрелых наивных клеток CD27-CD38+ (p=0.031), зрелых активированных клеток (CD27+CD38+) (p=0.044) и клеток памяти CD27+CD38- (p=0.019). Уровень наивных клеток различался (p=0.027) у пациентов с AMR (7.57% (2.83; 13.42)) по сравнению с пациентами с CAV (2.92% (1.24;3.39)). Данная классификация позволила выявить достоверные отличия (p=0.035) в уровне зрелых активированных клеток у пациентов с R0 (0.91% (0.48; 2.04)) в сравнении с пациентами с CAV (0.26% (0.17; 0.52)). Аналогично, уровень клеток памяти был повышен (p=0.011) у пациентов с R0 (0.64% (0.29; 1.29)) по сравнению с таковым у пациентов с CAV (0.21% (0.13; 0.36)). Алгоритм, основанный на анализе коэкспрессии CD27 и CD5, также выявил отличия (p=0.025) в уровне наивных CD5-CD27- клеток. Различия наблюдались между пациентами с AMR (7.88% (3.16; 13.19)) и CAV (3.44% (1.51; 4.24)). Кроме того, анализ популяций CD24++CD38++ показал различия между группами пациентов (p=0.041). Дискриминантный анализ, основанный на оценке уровня 46 цитокинов, показал, что цитокиновый профиль достоверно различался во всех изученных группах, и обладал высокой дискриминирующей способностью независимо от длительности посттрансплантационного периода. Как и ожидалось, анализ, выполненный на основе рутинных показателей (общий анализ крови, С-реактивный белок, креатинин, NT-proBNP), не выявил значимых дискриминирующих биомаркеров реакции отторжения. Наибольший дискриминирующий потенциал был достигнут при совместном анализе уровней цитокинов и параметров общего анализа крови независимо от длительности посттрансплантационного периода. В течение 1 года после ТС уровень шести цитокинов (IFNy, IL-12p40, M-CSF, MIP-1b, TGFa, TNFa) был статистически значимо выше в группе с отторжением по сравнению с группой без отторжения. В этот же период в группе с гуморальным отторжением было выявлено повышение уровня 11 цитокинов по сравнению с группой без отторжения. В период от 1 до 5 лет после ТС в группе с отторжением уровень восьми цитокинов (sCD40L, IFNa, IL-1a, Il-5, PDGF-AA, PDGF-AB/BB, TGFa, VEGF-A) был статистически значимо выше по сравнению с группой без отторжения. В тоже время, в группе с гуморальным отторжением статистически значимое снижение уровня наблюдалось для 4 цитокинов (sCD40L, Il-1a, Il-12p40, VEGF-A) и NT-proBNP, тогда как уровень гемоглобина и количество эритроцитов были повышены по сравнению с группой без отторжения. Профиль ВВ не показал значительных различий в первый год после трансплантации у пациентов с AMR, ACR или у R0. Однако более разнообразная картина изменений проявилась в промежутке от 1 года до 5 лет после трансплантации: значительные различия наблюдались во всех указанных группах, а также у реципиентов, у которых была диагностирована болезнь коронарных артерий (CAV). Интересно, что эта тенденция изменилась после 5 лет, и различия в основном исчезли, за исключением уровней SSEA-4+ ВВ, которые показали значительные изменения (p = 0.028) между группами в этот более поздний период. Дискриминантный анализ эффективно различал различные типы осложнений, возникающих в первый год после трансплантации, основываясь на профилях ВВ. Наиболее важными переменными в модели оказались ВВ, характеризующиеся наличием тетраспанинов (CD9+ и CD63+) и тромбоцитарными маркерами (CD62P+ и CD42a+), что указывает на роль этих ВВ в раннем развитии осложнений. Интересно, что в модель также вошли ВВ с маркерами, ассоциированными с активностью иммунных клеток (CD49e+, CD25+, CD19+, CD1c+), что подтверждает вовлеченность соответствующих экзосом в реализацию иммунных процессов. Дискриминационная способность профиля ВВ снижалась с течением времени, о чем свидетельствует увеличение значения ламбда Уилкса до 0.15202. Однако эта тенденция изменилась к 5 годам после трансплантации, когда увеличение предрасположенности к CAV совпало с возобновленной способностью различать группы по профилю ВВ. Несмотря на схожесть профилей ВВ между пациентами с CAV и R0, значительные различия проявились у пациентов с AMR и ACR, как друг относительно друга, так и по сравнению с группами CAV/R0. Это соответствовало увеличению числа ВВ, несущих маркеры, ассоциированные с активностью иммунных клеток (CD3+, CD4+, CD49e+, CD86+, CD20+, CD14+, CD209+, CD1c+, CD29+). В 2025 году были приготовлены библиотеки и проведено РНК-секвенирование короткоцепочечных РНК плазмы крови, выделенных от 30 пациентов после трансплантации сердца. Проведена первичная оценка показателей качества секвенирования, удаление адаптеров с 3’-конца и фильтрация по качеству прочтений, которая подтвердила высокое качество сырых данных. Начато проведение комплексного биоинформатического и функционального анализа данных высокопроцессивного РНК-секвенирования короткоцепочечных РНК. Во всех образцах были идентифицированы риды, картированные на отфильтрованные зрелые miRNA (Filtered.miRNA.reads), предшественники miRNA в форме "шпильки“ (Hairpin.miRNAs), зрелые транспортные РНК (mature tRNA.Reads), матричные РНК (mRNA.Reads), другие некодирующие РНК (ncRNA.others), первичные тРНК (primary.tRNA.Reads), рибосомальные РНК (rRNA.Reads), малые ядрышковые РНК (snoRNA.Reads). Подавляющее большинство ридов от 87 % до 92 % было картировано на отфильтрованные зрелые miRNA (Filtered.miRNA, далее микроРНК), от 7,12 % до 11,9 % приходилось на риды, картированные на другие некодирующие РНК (ncRNA.others), остальные классы РНК не превышали 2%.