Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проведен пассаж бактерий B. thuringiensis subsp. galleriae через чувствительную и устойчивую к бактериям B. thuringiensis линии вощинной огневки G. mellonella. Параллельно бактерии пассировали через искусственную питательную среду. Проведено сравнение и определены отличия исходного штамма и выделенных при пассированнии изолятов бактерий B. thuringiensis по морфологическим характеристикам, белковому профилю токсинов, наличию cry-генов в геномной, плазмидной ДНК, а также по синтезу РНК. Проведено сравнение вирулентности, определена полулетальной концентрации (ЛК50) выделенных изолятов бактерий по отношению к чувствительной линии насекомых. Показано, что три изолята обладают достоверно более высокой вирулентностью по сравнению с исходным штаммом бактерий. Поскольку выделенные изоляты бактерий различаются скоростью роста, формой образовываемых колоний, вирулентностью по отношению к насекомым чувствительной к бактериям B. thuringiensis линии, подготовлены образцы для секвенирования геномов исходного штамма и пяти пассированных изолятов бактерий B. thuringiensis для поиска отличий. Проведены пассажи энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana через вощинную огневку Galleria mellonella и хлопковую совку Helicoverpa armigera. Показано, что трехкратные пассажи энтомопатогенного гриба B. bassiana через чувствительных насекомых, вощинную огневку G. mellonella и хлопковую совку H. armigera, приводят к увеличению вирулентности гриба. Проведено сравнение морфологически различных вариантов бактерий B. thuringiensis ssp. aizawai по скорости роста, биохимическим и инсектицидным свойствам. Проведен анализ белкового профиля на наличие Cry белков, определено наличие cry-генов. Показано, что один из морфологических изолятов достоверно более вирулентный по отношению к личинкам вощинной огневки, по сравнению с исходным штаммом бактерий, в то время как третий изолят бактерий практически потерял вирулентность. На основе полученных данных подготовлена статья для публикации. Проведено сравнение вирулентности и уровня экспрессии генов вторичных факторов вирулентности бактерий B. thuringiensis на 1, 3, 5 и 7 день при культивации на агаризованной питательной среде (колонии) и в жидкой питательной среде (планктонная форма). Показано, что колонии B. thuringiensis достигают стадии споруляции раньше, чем планктонная форма. После трех дней роста на агаризованной питательной среде бактерии B. thuringiensis в два раза более вирулентные по отношению к личинкам вощинной огневки, чем в планктонной форме в жидкой питательной среде. Дифференциальная экспрессия генов-регуляторов кворума выявляет гетерогенность между планктонной и колониальной B. thuringiensis. На основе полученных данных подготовлена статья для публикации. Проведено сравнение вирулентности четырех различных подвидов бактерий B. thuringiensis по отношению к колорадскому жуку. Выделенные из эпизоотии вощинной огневки 2 штамма бактерий по микроскопическому анализу были охарактеризованы как бактерий B. thuringiensis. Проведено сравнение белкового профиля на наличие Cry белков, охарактеризовано наличие cry-генов. Для определения видовой принадлежности и подвида бактерий, подготовлены образцы на секвенирование генома данных бактерий. Выделенные изоляты бактерий обладают высокой инсектицидной активностью по отношению к личинкам колорадского жука, вощинной огневки и паутинному клещу. При реализации данного проекта для РНК-интерференции на вощинной огневке были выбраны гены антибактериальных белков Галиомицин и глутатион пероксидазы (FPx), а также компонента антиоксидантной системы Глутатион-трансфераза. Наработанные дцРНК были инъецированы в гемоцель насекомых в трех концентрациях 100нг, 500нг, 1000нг на личинку. Все исследуемые концентрации дцРНК приводят к снижению уровня экспрессии целевых генов в ткани жирового тела и кишечника. Было зарегистрировано достоверное (р<0.05) увеличение чувствительности насекомых к бактериям B. thuringiensis при инъекции 100нг дцРНК глутатион-пероксидазы в гемоцель. Результаты, полученные при реализации проекта, были представлены на четырех ведущих международных конференциях в виде приглашенных докладов, устных выступлений и стендовых докладов, а также в публикациях с СМИ (https://nsau.edu.ru/news/111439.html ; https://vk.com/wall-192463819_4767; https://nsau.edu.ru/news/111495.html ; https://vk.com/wall-192463819_4848; https://vk.com/wall-192463819_4981; https://vk.com/wall-192463819_4962)

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Проведено секвенирование геномов пяти штаммов бактерий B.thuringiensis, включая исходный и пассированные изоляты, с использованием коротких прочтений на платформе Illumina. По результатам геномного анализа был выявлен спектр инсектицидных токсинов, включая Mpp, Spp, Vip, Vpa/Vpb и Tpp, и 7 токсинов семейства Cry, а именно: Cry1Ga1, Cry1Ab35, Cry2Ab4, Cry1Fb1, Cry1Db1 и Cry1Ib7, Cry9Ba2. Методом анализа вариаций был показано, что наибольшее количество замен было выявлено в штамме Bt14, выделенном из живых устойчивых насекомых. Наиболее значимой была мутация в гене, кодирующем белок спорообразования GerAB. Таким образом, проведенный геномный анализ позволил охарактеризовать как общий инсектицидный потенциал бактерии, так и механизмы адаптации к заражению насекомых посредством мутаций в генах регуляции спорообразования, свидетельствуя о том, что механизмы адаптации изолятов происходят на уровне контроля формирования спор. Для валидации изменений, зарегистрированных в штаммах, был проведен анализ экспрессии генов с однонуклеотидными заменами у пассированных штаммов. Изменений в геноме по ключевым генам вирулентности у пассированных штаммов не было зарегистрировано, но предполагая наличие пост транскрипционных изменений, была проанализирована экспрессия генов основных факторов вирулентности на искусственной питательной среде (транскрипционные регуляторы вирулентной стадии plcR, некротрофной стадии nprR, спорообразования spoOA, коллагиназа ColA, металлопротеиназа M60, Bel, InhA2, InhA1, фосфолипаза С PlcAб хитиназа Chi, Cry-белка Cry1, Cry9). Показано, что экспрессия генов основных факторов вирулентности бактерий отличается среди изучаемых пассированных штаммов. Наиболее вирулентный штамм БТ14 характеризовался высокой базовой экспрессией генов вторичных факторов вирулентности, таких, как хитиназа, металлопротеиназы, а также плеотропных регуляторов основных фаз развития бактерий. Для поиска ключевых факторов и свойств, определяющих повышенную вирулентность пассированных штаммов, было проведено сравнение выделенных изолятов по скорости роста и спорообразования на ИПС, по скорости прорастания спор, по подвижности, по ферментативной активности, по способности образовывать биопленки, и антогонистическим свойствам. Для сравнения приспособленности пассированных бактерий (fitness), проведено сравнение продуктивности бактерий на ИПС и в погибшем хозяине, а также при совместной культивации каждого изолята с исходным штаммом на ИПС. В рамках данного блока работ проведено изучение влияния условий культивирования бактерий на жидкой и агаризованной питательной среде на вирулентность бактерий и уровень экспрессии генов факторов вирулентности. Зарегистрированы различные профили вирулентности и дифференциальную экспрессию генов, регулирующих кворум, между B. thuringiensis, растущими в жидкой планктонной среде, и колониями на твердой поверхности/среде. По результатам данного блока работ опубликована статья в журнале первого квартиля WoS (https://doi.org/10.1016/j.jip.2025.108301). Изучено течение инфекционного процесса у личинок вощинной огневки при заражении пассированными штаммами бактерий B. thuringiensis. Проведено сравнение иммунного ответа, активности антиоксидантных и детоксицирующих ферментов при заражении насекомых пассированными штаммами бактерий B. thuringiensis. Показано, что бактерии, пассированные через насекомых, изменяют свою стратегию развития инфекционного процесса. Изучено изменение микробиоты кишечника вощинной огневки при заражении пассированными штаммами бактерий B. thuringiensis. Проведено сравнение иммунного ответа, антиоксидантной системы и уровня экспрессии генов, отвечающих за механизмы резистентности, у личинок колорадского жука, зараженного различными по вирулентности подвидами бактерий B. thuringiensis. Проведено изучение комбинированного действия РНК-интерференции и заражения вощинной огневки и колорадского жука бактериями Bacillus thuringiensis, грибами рода Metarhizium. Показано, что дцРНК на гены Актина и АТФазы являются перспективными для повышения чувствительности колорадского жука к грибным и бактериальным биопрепаратам.. Для поиска ключевых генов, повышающих восприимчивость насекомых к энтомопатогенам, было проведено исследование кутикулярного ответа личинок вощинной огневки при парализации ядом эндопаразитоида Habrobracon hebetor, повышающей восприимчивость к грибному энтомопатогену M. robertsii. Полученные данные дают основание для выбора генов насекомых, которые можно использовать в качестве целевых, для повышения восприимчивости насекомых к биопрепаратам на основе грибных энтомопатогенов. По результатам данного блока работ подготовлена статья (Cuticle immunity and susceptibility to infection in Galleria mellonella larvae envenomed by the parasitoid wasp Habrobracon hebetor), подана в журнал Insect Phisiology (WoS, Q1, IF 2,4). Проведен поиск целевых генов хлопковой совки для РНК-интерференции с целью достижения летального эффекта, осуществлен дизайн праймеров, синтез двухцепочечных РНК. Достигнутые научные результаты реализации второго года проекта были представлены 9 докладами на 5 научных мероприятиях: 3 международные конференции (г. Вена, Австрия; г. Санкт-Петербург; г. Краснодар), и Всероссийская конференция для молодых ученных и студентов (г. Новосибирск). Публикации в СМИ, посвященные результатам проекта, были представлены в 13 публикациях, которые освящают участие руководителя и исполнителей проекта в международных и всероссийских конференциях, а также пресс-релиз на опубликованную статью по результатам реализации проекта ( https://vk.com/wall-175073387_1254, https://rscf.ru/news/release/vyrashchennye-na-tverdom-substrate-bakterii-bystree-obrazovali-spory-i-effektivnee-unichtozhili-nase/ , https://inscience.news/ru/article/world-science/agriculture/18308, https://xn--80aa3ak5a.xn--p1ai/news/bakteriy-nauchili-effektivnee-borotsya-s-nasekomymi-vreditelyami/ и другие).