Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В десяти регионах Российской Федерации, отобрано молоко от животных (коров). Животные были охарактеризованы методами ветеринарной медицины и по наличию и уровню содержания соматических клеток в молоке. Из образцов молока была выделена тотальная ДНК с помощью набора ZymoBIOMICS™ DNA Miniprep Kit («Zymo Research Corp», Канада) и EasyPure Microbiome DNA isolation Kit (TransGen Biocom, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Качество образцов ДНК оценивали электрофорезом образцов в агарозном геле. Вариабельные области V3–V4 гена 16S рРНК амплифицировались с использованием универсальных праймеров (341F_Illum_FP 5'-ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’; 806R_Illum_RP_Bac 5'-GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC TGG ACT ACH VGG GTW TCT AAT-3’). После оценки и очистки ПРЦ-продуктов библиотеку для сиквенса готовили по протоколу 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation («Illumina», США); геномные последовательности определяли на секвенаторе MiSeq 2x250 («Illumina», США). Полученные геномные чтения обрабатывались через платформу Nephele (http://nephele.niaid.nih.gov). Качество сиквенса проверяли с помощью FastQC toolkit (Andrews, 2018). Операционные таксономические единицы (ОТЕ) получали сравнением с базой данных SILVA (Yilmaz et al., 2014). Распространение ОТЕ в образцах и различия в структуре микробных сообществ оценивали с помощью программного пакета QIIME (Caporaso et al., 2010). Таксономическую идентификацию чистых микробных культур проводили как с помощью анализа последовательностей генов 16S рРНК через платформу BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov), так и при помощи сравнения средней нуклеотидной идентичности (ANI). Проведен предварительный анализ штаммов методами микробиологии, определены устойчивость к антибиотикам и проведена биохимическая характеристика штаммов. Из образцов молока, полученного от больных животных было выделено 153 штамма, из них S. aureus – 51%, E. coli – 9,2%, Str. agalactiae – 26,8%, Cl. perfringens – 1,3%, Bacillus spp. – 5,2%, Enterococcus spp.- 6,5%. Микробиологические исследования показали, что основным возбудителем мастита в исследуемых региона является Staphylococcus aureus (51% выделенных штаммов). В нашем случае, S. aureus выделялся в большинстве проб молока, но имел разницу по фенотипическим признакам, что может говорить о возможных выявленных MRSA штаммах. В рамках исследования, из Дальневосточного ФО был выделен 31 штамм S. aureus, из них 88,46%, 38,46%, 80,77%, 92,31%, 53,85%, 92,31% и 73,08% были устойчивы к бензилпенициллину, цефокситину, гентамицину, эритромицину, линкомицину, рифампицину и ципрофлоксацину соответственно. В Уральском ФО было выделено 5 чистых штаммов, все из которых были устойчивы к этитромицину и в 80% случаев к бензилпенициллину, гентамицину, рифампицину. Выделенный в Уральском ФО (Тюменская область) штамм C. perfringens был чувствителен к стрептомицину, пенициллину, гентамицину, амоксициллину, хлорамфениколу, ципрофлоксацину, канамицину и амикацину и высокоустойчив к цефатоксину, колистину сульфату, поликсину B, линкомицину, триметоприму, эритромицину, тетрациклину, неомицину сульфату и метронидазолу. Также стоит отметить, что в образцах молока из Тюменской области и Камчатского края были выделены консорциумы S. aureus c Bacillus spp, E.coli и Clostridium spp. Из десяти штаммов, охарактеризованных как коагулазо-негативные стафилококки, выделялась ДНК, используя набор Thermo Scientific GeneJET DNA Purification Kit. Полногеномное секвенирование чистой культуры бактерий – выделенных штаммов с получением 1ГБ/образец на платформе GeneMind. Секвенирование чистой культуры бактерий с использованием длинных прочтений (ONT) 1Гб на образец. Методами биоинформатики проведена обработка результатов секвенирования, собраны геномы и проведен поиск и анализ факторов вирулентности и устойчивости к антибиотикам. Были просеквенированы 10 микроорганизмов, основное внимание в работе сделано на исследовании 8 штаммов коагулазо-негативных стафилококков. В настоящее время проводится регистрация геномов штаммов в международной базе данных. Построены профили микробиомов, убраны низкокачественные чтения, химерные последовательности и образцы с низким покрытием. Получен набор данных из 2870927 высококачественных чтений со средним значением 60413 чтений на образец. Выявлены ОТЕ 16 бактериальных типов со средней относительной численностью более 0,1%, причем шесть типов (Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Tenericutes и Fusobacteria) в совокупности составили это 97% от всех сиквенсов, что показано на рис. 1. Для каждой группы (H/S/M) проведен LEfSe (Linear discriminant analysis effect size) — алгоритм для обнаружения многомерных биомаркеров. Для субклинического мастита характерно присутствие в том числе Fusobacterium и Ignavigranum; для мастита – Enterobacter, Streptococcus, Acinetobacter, Escherichia и Mycoplasma; для здоровых животных – Bacillus.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Наиболее значимые результаты получены при исследовании микробиоты молока, полученного от коров больных маститом в Регионах РФ. Важно и интересно разнообразие присутствия отдельных микроорганизмов в молоке. Северо-Запад: образцы молока, где доминирует Lactococcus lactis, очевидно относятся к тем случаям мастита, которые не вызваны бактериальными агентами, хотя доля представителей энтеробактерий, таких как Citrobacter spp. и Raoultella spp. Была высока. Тем не менее, причина мастита, как мы считаем, в этом случае заключается не в них; однако в ряде случаев их доля суммарно возрастала, тогда как доля L. lactis фактически исчезала, и это уже несомненно указывало на непосредственную роль данных энтеробактерий в возникновении/протекании заболевания. Отдельный случай мастита был явно связан с двумя патогенными видами, Fusobacterium necrophorum и Porphyromonas sp. Эти данные характерны для животных Ленинградской области. Для случаев мастита у коров Калининградской области характерно присутствие коагулазо негативных стафилококков, в том числе Staphylococcus sciuri. Периодически наблюдалось присутствие характерного для мастита патогена Streptococcus dysgalactae. В Центральном регионе главным микробным фактором мастита являлись коагулазо-негативные стафилококки, S. hyicus и S. sciuri, в некоторых пробах значительно увеличивалось присутствие различных видов клостридий. Для образцов из Краснодарского края, наблюдалось доминирование бактерий рода Pseudomonas, причем наиболее распространены были виды P. putida и P. lundensis, которые давно и хорошо известны и никогда не рассматривались как патогены. В Сибирском регионе, в ряде случаев инфицирующим агентом выступали микоплазмы. Другую клиническую картину создавали энтеробактерии в виде E. coli или Rahnella sp., при этом их сопровождали как микоплазмы, так и клостридии. В одном случае, кроме Rahnella sp., опять наблюдалось присутствие псевдомонад. Но два образца молока давали очень нетипичную картину, если с абсолютным доминированием псевдомонад мы уже сталкивались в образцах из южных регионов России, то доминирование продуцента полимиксина, Paenibacillus polymyxa в молоке коров, больных маститом, было нами зафиксировано впервые. Для Дальневосточного Региона большинство образцов из Еврейской АО суммарно превалируют два рода, Serratia и опять же Pseudomonas. При этом наблюдалось некое равновесие в количестве обоих представителей. В единичных случаях наблюдалось доминирование Acinetobacter sp., Chryseobacterium anthropi и Staphylococcus chromogenes. В образцах молока от коров Хабаровского края, соседнего региона с Еврейской АО, то они демонстрируют наиболее общую для себя картину: три рода представлены в примерно равном соотношении, это Lactococcus, Aeromonas и Enterobacter. Здесь не приходится говорить о каком-либо явном влиянии бактериального агента на возникновение либо протекание мастита, хотя и исключать их влияние полностью нельзя. Наиболее интересное наблюдение, полученное в данной работе – это присутствие в подавляющей концентрации от общего микробного числа продуцента естественного антибиотика полимиксина в пробах молока больных коров. Применение живых культур Paenibacillus polymyxa как протектора и пробиотика в профилактике и лечении мастита на наш взгляд имеет хорошие перспективы в народном хозяйстве.