Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Исследования 2024 года были посвящены выделению и анализу циклических пептидов семени льна и верификации моделей in vivo для оценки их биологической активности. В работе были использованы семена и выделенное из них масло 5 российских сортов льна масличного, в числе которых сорта «Бирюза», «ФЛИЗ», «РФН», «Ы-117» и «НИЛИН». Разработан аналитический метод качественного и полуколичественного определения циклических пептидов с использованием хроматографической системы Agilent 1200 Series с диодно-матричным детектором. Установлено, что эффективное разделение циклических пептидов достигается при использовании хроматографической колонки ReproSil-Pur Basic-С18 размером 250×3 мм зернением 3 мкм в градиентом режиме элюирования в системе вода- ацетонитрил. Температура термостата колонок – 30°С, скорость потока подвижной фазы – 0,3 мл/мин, объём вкола – 3 мкл. Детектирование осуществлялось на длинах волн 214, 244 и 280 нм. Качественный состав циклических пептидов подтверждался масс-спектрами фрагментации, полученными в положительном режиме с использованием масс-спектрометра типа «линейная ловушка», оснащенного источником ионизации «прогреваемый электроспрей». С использованием разработанной методики был проведен анализ содержания циклических пептидов льна. Качественный состав циклических пептидов идентичен во всех 5 образцах и включает как неокисленные циклические пептиды (CLA, CLB, CLD, CLE, CLF и CLG), так и окисленные формы некоторых ЦП. Наибольшим содержанием пептидов характеризовался сорт Ы-117 (0,06%). Содержание ЦП в остальных сортах варьировалось в диапазоне 0,03-0,04%. Проведен анализ химического состава семян льна по показателям содержания белков, жиров, жирных кислот, углеводов, золы, воды, токоферолов, железа, меди, цинка, кобальта, марганца, полифенольных соединений. Определены значения перекисного числа, общей антиоксидантной активности и периода индукции. Показано, что содержание CLA наиболее тесно коррелирует с содержанием линолевой кислоты, CLB – с содержанием стеариновой кислоты и урожайностью, CLD – с содержанием α-линоленовой кислоты и периодом индукции при 90 °C , CLF – с содержанием пальмитиновой кислоты и белка, CLG – с содержанием цинка, γ-токоферола, общего содержания токоферолов. Разработан лабораторный метод препаративного выделения циклических пептидов из семян льна, включающий отделение фракций полисахаридов и лигнанов в виде побочных продуктов. В качестве источника циклических пептидов для лабораторных целей использовали льняное масло холодного отжима после центрифугирования. В качестве экстрагента был выбран этанол как наименее токсичный из применяемых растворителей. Процедура выделения ЦП включала этапы экстракции из масла водным раствором этанола, центрифугирования, отбора супернатанта и выпаривания экстрагента с образованием препарата сухих пептидов льна. В ходе выполнения работ была проведена оптимизация всех этапов экстракции. Выполнены верификация и выбор модели окислительного стресса in vivo с использованием 50 крыс-самцов линии Вистар с исходной массой тела 100±2г (возраст 4 недели). Животных рандомизированно по массе тела и результатам теста «Открытое поле» разделили на 4 равные группы: К1 (контрольная группа), Г2, Г3 и Г4. Были верифицированы 3 биологические модели окислительного стресса: Г2 - введение в рацион повышенной квоты холестерина, фруктозы, замена части жирового компонента на маргарин; Г3 - модель иммобилизации животных; Г4-медикаментозная модель однократной внутрибрюшинной инъекции CCl4. Потребление животными холестерина и фруктозы приводило к развитию неалкогольной жировой болезни печени, характеризуемой увеличением относительной массы печени, экстремальным накоплением в ней жира, холестерина и триглицеридов. Выявлено достоверное увеличение концентрации аланинаминотрансферазы в сыворотке крови, сопровождающееся значительными изменениями антиоксидантного статуса крыс: накопление МДА и активация СОД в сыворотке крови животных. У этих животных выявлено развитие гиперлипидемии, выраженное увеличением концентрации общего холестерина и холестерина ЛПНП в сыворотке крови. Показано нарушение белкового и углеводного обменов. Полученные данные будут использованы при моделировании гиперлипидемии, для воспроизведения in vivo неалкогольной жировой болезни печени и для оценки состояния окислительного стресса в организме животных. Однократная внутрибрюшинная инъекция ССl4 на фоне потребления животными подсолнечного масла приводила к достоверному увеличению в крови перекисного окисления липидов, характеризуемого накоплением гидроперекисей липидов и активацией каталазы. Показано развитие токсического поражения печени, характеризуемое увеличением концентрации АЛТ в сыворотке крови и холестерина в печени. Помимо этого, было выявлено нарушение углеводного обмена, выраженное снижением глюкозы и гликированного гемоглобина в крови животных. Однократное внутрибрюшинное введение ССl4 на фоне снижения квоты омега-3 жирных кислот в рационе животных сопровождается изменением ряда биохимических показателей, характеризующих окислительный стресс, и может быть использовано для изучения эффектов антиоксидантов в эксперименте in vivo. Опубликовано 2 статьи в рецензируемых научных изданиях, результаты работ представлены в 5 докладах и лекции на научных конференциях; результаты работ освещены в СМИ: https://здоровое-питание.рф/healthy-nutrition/articles/tsiklicheskie-peptidy-semyan-lna-perspektivy-primeneniya/

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
На протяжении 2025 года в рамках выполнения проекта получены комплексные результаты, закладывающие основу для дальнейшего практического использования циклических пептидов (ЦП) льна. Ключевым достижением стала разработка и оптимизация полного технологического цикла получения высокочистых целевых соединений. Экспериментально установлено, что экстракция 70% водным раствором этанола из масла льна сорта «Ы-117» в соотношении 1:8 обеспечивает максимальный выход пептидов при минимальном содержании сопутствующих полифенолов. Для принципиального улучшения качества продукта впервые предложена и апробирована стадия очистки экстракта березовым активированным углем, позволяющая эффективно удалять окрашивающие каротиноидные пигменты. Подтверждением эффективности очистки служат объективные колориметрические показатели: индекс белизны вырос с 66,1 до 79,3, а индекс желтизны снизился с 50,9 до 23,8. При этом, хромато-масс-спектрометрический анализ подтвердил сохранение полного профиля из 11 целевых циклических пептидов. Таким образом, отработана воспроизводимая методика лабораторного получения стандартизированных образцов ЦП, что является обязательным условием для любых последующих исследований. Параллельно создан и валидирован точный аналитический метод для контроля качества и количественной оценки. Подобранные условия высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с фенилгексильной фазой обеспечивают селективное разделение восьми основных циклических пептидов за 15 минут. На основе выделенных методом полупрепаративной ВЭЖХ индивидуальных стандартов с чистотой 81–97% построены линейные калибровочные зависимости. Воспроизводимость метода подтверждена низкими коэффициентами вариации (менее 1%). Его применение позволило впервые установить точное количественное содержание ЦП в российском сырье: суммарное количество в масле льна сорта «Ы-117» составило 659,02 мг/л, при этом доминирующими компонентами являются пептиды CLB (208,24 мг/л) и CLA (179,06 мг/л). Было проведено тестирование острой токсичности циклических пептидов льна при внутрижелудочном поступлении методом фиксированной дозы (2000 мг/кг м.т.) на мышах самцах и самках линии ICR. Зафиксирована гибель двух животных в каждой из опытных групп. Выраженные признаки токсичности у других животных отсутствовали, соответственно согласно ГОСТ 32644 препарат ЦП характеризуется, как имеющий класс токсичности V (LD50 > 2000 мг/кг). Класс опасности 5 идентифицирует исследуемые вещества, как относящиеся к низкому классу острой токсической опасности, но при определенных условиях представляющих опасность для более уязвимых популяций. Для этих веществ уровень DL50/LD50 предположительно находится в диапазоне концентраций 2000- 5000 мг/кг при пероральном введении. Проведено исследование субхронической токсичности циклических пептидов льна в дозах 1, 10 и 100 мг/кг м.т. в 28-суточном эксперименте на крысах-самцах линии Вистар согласно ГОСТ 32641— 2014 «Определение токсичности при повторном/многократном пероральном поступлении вещества на грызунах. 28-дневный тест». Судя по показателям прироста массы тела и потребляемости корма, нормальной массе внутренних органов, отсутствию летальности и анатомических признаков патологии органов при выведении животных из эксперимента, крысы всех групп благоприятно переносили потребление предлагаемых дозировок циклопептидов льна. Проведенное исследование показало наличие у животных опытных групп изменений в показателях антиоксидантной защиты и окислительного стресса, а также липидного профиля печени. Однако согласно полученным нами данным, выбранные дозировки ЦП льна, по-видимому, не оказывают дозозависимого влияния на рассматриваемую группу показателей и даже оказываются антагонистическими. Для определения возможных направлений практического применения проведена всесторонняя характеристика свойств ЦП. Составленный впервые согласованный органолептический профиль выявил наличие у очищенных пептидов горького вкуса и выраженного тригеминального ощущения в послевкусии, что диктует необходимость маскировки или капсулирования при включении в пищевые продукты. Изучение поверхностной активности показало способность ЦП к образованию пленок на межфазной границе и взаимодействию с ионами поливалентных металлов (железа, меди, цинка, селена, марганца), что открывает перспективы их использования в качестве стабилизаторов пищевых систем и природных хелаторов. Начата работа по созданию модельных эмульсионных систем, обогащенных ЦП, и оценке их окислительной стабильности. Все запланированные задачи по научной коммуникации, включая участие в конференциях и подготовку публикаций, выполнены в полном объеме. В совокупности, полученные в отчетном году результаты формируют прочный научно-технологический фундамент, подтверждающий безопасность и перспективность циклических пептидов льна как нового класса биологически активных соединений для пищевой и фармацевтической промышленности, и задают четкие векторы для исследований 2026 года, посвященных изучению направленной биологической активности и разработке конкретных продуктов.