Изучение процесса старения яйцеклеток и механизмов его регуляции как основа для разработки новых подходов к получению клонированных и in vitro эмбрионов сельскохозяйственных животных

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-16-00261

НазваниеИзучение процесса старения яйцеклеток и механизмов его регуляции как основа для разработки новых подходов к получению клонированных и in vitro эмбрионов сельскохозяйственных животных

Руководитель Сингина Галина Николаевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста" , Московская обл

Конкурс №92 - Конкурс 2024 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-204 - Животноводство

Ключевые слова получение эмбрионов in vitro, ооциты, созревание старение, ультраструктурный анализ, молекулярные механизмы, прогестерон, клеточные цитокины, антиоксиданты

Код ГРНТИ68.03.05

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Разработка новых подходов к производству высококачественных эмбрионов крупного рогатого скота методом экстракорпорального оплодотворения (in vitro embryo production, IVEP) и соматического клонирования (somatic cell nuclear transfer, SCNT) является важной задачей современной современных репродуктивныхой биотехнологийи. В скотоводстве IVEP-технология широко используются для получения большего количества потомков от лучших матерей с целью повышения степени реализации их генетического потенциала в последующих поколениях, для сохранения малочисленных и генофондных пород, а также для увеличения темпов генетического прогресса в селекции у крупного рогатого скота. SCNT, в свою очередь, позволяет тиражировать ценные генотипы, а в сочетании с методом геномного редактирования является наиболее эффективным инструментом создания животных с новыми хозяйственно-полезными признаками. Одним из основных подходов, позволяющим решить задачу повышения качества эмбрионов, полученных вне организма, является идентификация факторов, отвечающих за механизмы защиты ооцитов в процессе их созревания in vitro от преждевременного старения, которые у крупного рогатого скота исследованы лишь в незначительной степени. Объектом исследования будут служить post mortem ооциты, а также донорские ооциты от индивидуальных коров, полученных с помощью Ovum pick-up. Целью представленного проекта является изучение влияния определенных эндокринных и паракринных факторов, в том числе секретирумых в фолликулярную жидкость и участвующих в регуляции созревания ооцитов, на цитологические и молекулярные изменения, ассоциированные с процессом старения яйцеклеток у коров, а также идентификация механизмов такого влияния. Среди известных факторов будут исследованы прогестерон и клеточных клеточные цитокины, а также антиоксиданты и везикулярный белок, которые будут использованы либо во время созревания ооцитов, либо экстракорпорального оплодотворения. В ходе выполнения проекта планируется охарактеризовать механизмы влияния выбранных факторов, потенциально снижающими оксидативный стресс пролонгированного культивирования, на качество стареющих ооцитов. С помощью современных методов будут детально исследованы как морфологические, так и биохимические изменения ооцитов и окружающих клеток кумулюса в процессе старения, и при добавлении выбранных факторов in vitro. Планируется сравнить функционирование молекулярных механизмов, ассоциированных с инициацией старения яйцеклеток в присутствии исследуемых веществ. Для этого будут проведены анализ экспрессии генов в клетках кумулюса, активность мейотических киназ и антистрессовых белков в зрелых и состарившихся ооцитах, ультраструктурный анализ органелл на серийных срезах с помощью электронной микроскопии. Будут исследованы состояние хромосом при поддержании и снятии блокады мейоза в стадии метафазы II, апоптоз, структура и активность митохондрий и распределение липидных гранул в ооцитах. Также будут исследованы ответные механизмы ооцитов и клеток кумулюса с помощью анализа регуляторных микроРНК, содержащихся во внеклеточных везикулах, секретируемых клетками в процессе созревания и старения in vitro. В результате выполнения предлагаемого проекта будут получены новые данные, необходимые для понимания эндокринных и паракринных механизмов, регулирующих процессы старения в завершивших созревание ооцитах. В финальной части проекта планируется провести оценку влияния установленных «антивозрастных» факторов на качество IVEP и SCNT-эмбрионов. Реализация проекта позволит выявить новые подходы и разработать методы, которые позволят повысить эффективность IVEP и SCNT-технологий у крупного рогатого скота, что будет способствовать их практическому использованию в скотоводстве.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Изучена динамика морфофункциональных и ультраструктурных изменений в созревших вне организма ооцитах в процессе их старения in vitro. Ооциты получали mortem и прижизненно методом трансвагинальной аспирации фолликулов (ovum pick up, OPU). Установлено, что старение и потеря нормальных морфологических характеристик для post mortem ооцитов происходит на более ранних сроках старения, чем для OPU-ооцитов. Удвоение хромосом в post mortem ооцитах было отмечено уже через 12 часов старения, тогда как для OPU-ооцитов это происходило только через 24 часа старения. Ультраструктурное исследование митохондрий также показало меньшую устойчивость в процессе старения post mortem ооцитов по сравнению с OPU-ооцитами. Через 24 часа старения митохондрии в OPU-ооцитах сохраняли нормальную ультраструктуру, в то время как в post mortem через 24 часа старения уже были отмечены признаки функциональной деградации митохондрий. Проведены исследования в направлении поиска факторов, потенциально связанных с устойчивостью ооцитов коров к возрастным трансформациям в процессе их созревания in vitro. Сравнивали действие потенциальных регуляторов качества ооцитов: прогестерона (P4), инсулиноподобного фактора роста (IGF1), фактора роста фибробластов (FGF), дитиотреитола (DTT), а также везикулярного белка фолликулярного происхождения (ВБФ). Показано положительное влияние P4, IGF1, FGF, DTT и ВБФ на устойчивость яйцеклеток к возрастным трансформациям. При воздействии во время созревания ооцитов in vitro в них наблюдается снижение уровня деструктивных изменений хромосом и апоптоза при последующем пролонгированном культивировании. Получены данные о влиянии P4, IGF1, FGF, DTT, ВБФ в период созревания ооцитов на их эмбриональном развитии (в следствие экстракорпорального оплодотворения) после старения. Долгосрочный эффект на развитие оплодотворенных ооцитов до стадии бластоцисты наблюдался только для IGFI и ВБФ. Эти же факторы влияли на качество развившихся бластоцист: оба снижали уровень апоптоза в эмбрионах, а IGFI дополнительно повышал их полноценность, оцененную по общему количеству ядер в бластоцистах Проведена оценка возможности нивелирования возрастных трансформаций в созревших in vitro ооцитах в процессе их экстракорпорального оплодотворения в присутствие тестируемых факторов. Получены результаты, свидетельствующие о положительном влиянии P4, IGF1, DTT и ВБФ в период оплодотворения ооцитов, на качество развившихся из них эмбрионов. DTT и ВБФ положительно влияет на уровень апоптоза, а P4 и IGF1, кроме того, повышает полноценность бластоцист.

Публикации

1. Жукова А. С., Лопухов А.В. Влияние различных концентраций фактора роста фибробластов 2 на созревание и качество ооцитов коров в условиях in vitro. Животноводство и кормопроизводство (год публикации - 2025)

2. Сингина Г.Н., Узбеков Р.Э., Шедова Е.Н., Верн Т., Узбекова С.В. УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ, БИОХИМИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ООЦИТОВ КОРОВ ПРИ СТАРЕНИИ in vitro. Онтогенез (год публикации - 2026)

3. Сингина Г.Н., Шедова Е.Н., Чинаров Р.Ю. Результативность получения IVP эмбрионов у крупного рогатого скота в зависимости от условий оплодотворения ооцитов, выделенных post mortem и методом OPU. Зоотехния (год публикации - 2026)

4. Сингина Г.Н., Шедова Е.Н., Лопухов А.В. Влияние различных концентраций инсулиноподобного фактора роста 1 на in vitro созревание ооцитов и последующее развитие партеногенетических эмбрионов у крупного рогатого скота. Аграрная наука, Т. 401, № 12, С. 93–98 (год публикации - 2025)
10.32634/0869-8155-2025-401-12-93-98

5. СИНГИНА Г.Н., ШЕДОВА Е.Н., ЛОПУХОВ А.В., ЖУКОВА А.С. ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ ИНСУЛИНОПОДОБНОГО ФАКТОРА РОСТА 1 И ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ 2 НА КАЧЕСТВО СОЗРЕВАЮЩИХ ООЦИТОВ И ИХ СПОСОБНОСТЬ К ЭМБРИОНАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ in vitro» У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (Bos taurus taurus). Сельскохозяйственная биология (год публикации - 2025)

6. Сингина Г.Н., Шедова Е.Н., Узбеков Р.Э., Узбекова С.В. Влияние внеклеточных везикул, происходящих из овариальных фолликулов различного размера, на созревание ооцитов и их развитие in vitro до стадии бластоцисты у коров. Сельскохозяйственная биология (год публикации - 2026)

7. Сингина Г.Н. Присутствие экзосом фолликулярного происхождения в среде созревания ооцитов повышает их качество и способность к эмбриональному развитию in vitro. Материалы VI Международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы». – Минск. – 18-20 ноября 2025 г., с. 220. (год публикации - 2025)

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
1. Проведены дополнительные исследования, направленные на поиск факторов, потенциально связанных с устойчивостью ооцитов коров к возрастным трансформациям в процессе их созревания in vitro. Показано, что воздействие антиоксиданта кумарина на коровьи ооциты во время созревания in vitro способствует повышению качества яйцеклеток, а также их способности к эмбриональному развитию вследствие экстракорпорального оплодотворения. Первое проявляется в ускорении и повышении уровня ядерного созревания ооцитов, снижении степени деструктивных изменений и апоптоза в хромосомах 2-го мейотического деления, второе — в увеличении процента раздробившихся ооцитов после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и развившихся из оплодотворенных ооцитов бластоцист, а также в повышении качества полученных бластоцист. Кроме того, эти эффекты имеют долговременный характер и сохраняются после пролонгированного культивирования созревших клеток, вызывающего их старение, что указывает на повышение устойчивости ооцитов к возрастным трансформациям в присутствии указанного антиоксиданта. 2. Проведено сравнительное исследование влияния инсулиноподобного фактора роста (IGF1) и внеклеточных везикул фолликулярного происхождения (ffEVs), которые определенны на первом этапе выполнения проекта как связанные с устойчивостью яйцеклеток коров к возрастным трансформациям, на уровень окислительного стресса (ROS) и уровень внутриклеточного глутатиона (GSH) в созревающих и стареющих ооцитах коров. Обнаружено, что одним из возможных механизмов влияния ffEVs и IGF1 на качество ооцитов, включая устойчивость яйцеклеток к старению, является их участие в регуляции окислительно-восстановительных процессов. В тоже время, очевидно, что молекулярные пути положительного влияния у этих факторов различаются, и свидетельствуют о большем вовлечении ffEVs в регуляцию старения, в сравнении с IGF1. 3. В целях характеристики молекулярных изменений в ооцитах коров, стареющих in vitro был проведен транскриптомный анализ клеток кумулюса (КК), окружающих ооциты, после 20 ч созревания (0 ч старения), и последующих 12 ч и 24 ч старения. Обнаружено, что 24-часовое культивирование (24 h старения) после 20 ч созревания запускает в клетках кумулюса (КК) сложный адаптационный ответ, который может негативно сказываться на способности КК поддерживать ооцит. Переход клеток кумулюса из пролиферативного, активно ремоделирующего состояния в покоящееся состояние с признаками характерными для сосудообразующих клеток, является метаболическим и функциональным сдвигом, который может быть благоприятен для ооцита в начале культуры старения (до 12 ч), так как перераспределяет ресурсы в пользу финального созревания яйцеклетки. Однако в системе пролонгированного культивирования (24 ч) значительное подавление генов внеклеточного матрикса и адгезии может указывать на начало дедифференцировки клеток кумулюса, потерю целостности матрикса и ухудшение контактов с ооцитом. В конечном итоге это может привести к снижению компетентности ооцита к эмбриональному развитию. 4. Изучали молекулярные механизмы благоприятного действия добавления внеклеточных везикул фолликулярной жидкости ffEVs в среду для созревания ооцитов in vitro (IVM) для нейтрализации негативных изменений, вызванных длительным культивированием (старением). Провели протеомный анализ индивидуальных ооцитов, что является первыми исследованиями такого типа у коров. Результаты данного протеомного анализа показали, что обработка ОКК препаратами, обогащенными экзосомами фолликулярной жидкости, меняет белковый профиль ооцитов, что способствует изменению кинетики мейотического деления, энергетического метаболизма и ответа на стресс. Культивирование ооцитов in vitro, тем более продолжительное, является сильным стрессом, требующим адаптации клеток. Наличие в среде культивирования внеклеточных везикул, секретированных разными клетками фолликула, возможно дает ооциту не только белковый и липидный материал, но и разные типы РНК, и регуляторные элементы, как микро РНК или сигнальные липиды. Это меняет его метаболизм, и в некоторых случаях приводит к улучшению его компетенции к раннему эмбриональному развитию.

Публикации